Частота ошибок днк полимеразы

Многие методы исследования в области молекулярной биологии требуют миллионов идентичных копий чистой ДНК. Полимеразная цепная реакция — это молекулярный метод, имитирующий процесс репликации дезоксирибонуклеиновой кислоты для амплификации определенных сегментов ДНК in vitro. Реакция повторяется через серию изменений температуры, во время которых нити ДНК разделяются, праймеры связываются и образуются комплементарные нити.

Эволюция ДНК-полимераз                                                                 

Прогресс в ПЦР был бы невозможен без эволюции ДНК-полимераз — специализированных ферментов. 

История современной ПЦР началась в 1976 году с выделения ДНК-полимеразы Taq из термофильной бактерии Thermus aquaticus. Выявление бактерии означало, что у молекулярных биологов появился термостабильный фермент, способный к повторному циклу ПЦР без необходимости добавления свежей ДНК-полимеразы после каждого цикла.

Однако влияние, которое фермент Taq окажет на молекулярную биологию, не был ясен до 1988 года, пока фермент не коммерциализировали для широкого использования. ДНК-полимераза Taq имела мгновенный успех, и в 1989 г. даже была названа журналом Science «Молекулой года».

Хотя эти разработки представляли собой значительный прогресс, ДНК-полимераза Taq не была идеальной. Анализ с ее использованием был нестабилен при высоких температурах и подвержен ошибкам. Эти факторы сыграли роль в задержке развития возможностей ПЦР на раннем этапе, особенно в приложениях, требующих высокой специфичности и надежности. Вскоре стало очевидно, что разработка ДНК-полимераз неразрывно связана с эффективным использованием ПЦР, и что для увеличения мощности ПЦР и открытия более широкого спектра возможностей анализа необходимо разработать более совершенные ДНК-полимеразы.

В конце 1980-х годов появился ряд методов с использованием «горячего старта», помогающих преодолеть неэффективность и низкую специфичность ДНК-полимеразы Taq при высоких температурах. Эти методы заключались в нагревании образцов до 95°C и последующем охлаждении до 60–70°C перед добавлением полимеразы. Несмотря на эффективность, методы горячего старта отнимали много времени и часто вызывали перекрестное загрязнение проб. ПЦР требовалось долгосрочное решение.

В 1991 г. были выделены и разработаны полимеразы Pfu, полученные из гипертермофильных архей Pyrococcus furiosus. ДНК-полимераза Pfu, в отличие от ДНК-полимеразы Taq, имеет встроенную корректирующую активность экзонуклеазы от 3 ‘до 5’, что означает, что она может исправлять ошибки включения нуклеотидов, значительно снижать частоту ошибок и обеспечивать повышенную специфичность. Разработка и использование как полимераз Pfu, так и Taq продолжались в течение некоторого времени, при этом ПЦР сыграла важную роль в ряде новаторских исследований, таких как секвенирование.

Внедрение слитых ДНК-полимераз в 2003 году, стало первым шагом в разработке полимераз нового поколения и ПЦР высокой точности. Эти специально сконструированные ДНК-полимеразы могли преодолеть или уменьшить многие проблемы, все еще ограничивающие развитие ПЦР. Созданные путем слияния основных компонентов архебактериальной полимеразы с термостабильным ДНК-связывающим доменом, первые ДНК-полимеразы Phusion High Fidelity обладали сильной корректирующей способностью и были невероятно стабильны при высоких температурах реакции. Кроме того, при использовании специализированного ДНК-связывающего домена сродство полимеразы к двухцепочечной ДНК увеличивалось в геометрической прогрессии.

Разработка полимераз следующего поколения наряду с развитием технологий ПЦР в реальном времени и цифровой ПЦР гарантировала, что ПЦР будет играть важную роль в будущих исследованиях в области наук о жизни и здравоохранении.

Что такое полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — важнейший лабораторный метод исследования тонкой молекулярной структуры генетического материала. Он состоит из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), составляющей генетический код человека, а также животных и растений.

В медицине анализ используется для уточнения наследственных заболеваний и генетических проблем (риск заболевания, тест на отцовство и т. д.), а также для диагностики многих инфекционных заболеваний. В отличие от серологической диагностики (определение антител к возбудителям в крови) способы полимеразной цепной реакции представляют собой прямой лабораторно-медицинский метод выявления в рамках уточнения инфекционных заболеваний.

Преимущество этого способа диагностики — быстрая доступность результатов. Кроме того, методы полимеразной цепной реакции обладают очень высокой чувствительностью. Это означает, что даже минимальное количество генетического материала от возбудителя (бактерии, вирусы и т. д.) приводит к достоверно положительному результату при наличии соответствующего патогена в нужном исследуемом материале. 

Кровь — основной исследуемый материал для этого метода, однако используются и другие биологические жидкости (мокрота, моча, ликвор и т. д.). В основе генетического материала лежит особая длинноцепочечная молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты.

У людей генетический материал, состоящий из двухцепочечной ДНК (две комплементарные нити), находится в ядре всех клеток организма, при этом они имеют идентичный генетический материал. Кроме того, индивидуальный геном каждого человека уникален по своему точному составу и сравним с отпечатком пальца, также уникального для каждого человека.

По этой причине генетический материал также называют «генетический код». В этой форме закодирована схема всех структур человеческого организма, таким образом она сохраняется и в дальнейшем может передаваться по наследству.

В ядрах клеток тела дезоксирибонуклеиновая кислота присутствует в особом порядке, известном как хромосомы (наследственные клетки). У людей они всегда встречаются парами, причём, одна наследуется от матери, а другая — от отца. Все клетки человеческого тела содержат в общей сложности 46 хромосом — 22 пары, называемые аутосомами, и одну пару, называемую половыми хромосомами.

Лабораторная процедура может быть использована для исследования тонкой структуры генетического кода человека, что важно при диагностике заболеваний или уточнении конкретных вопросов:

• выявление наследственных заболеваний;
• оценка риска заболевания;
• исследование врожденных особенностей обмена веществ;
• судебно-медицинская (так называемая «криминалистическая») экспертиза.

Не только люди, но и фактически все формы жизни на Земле имеют определенный генетический материал:

• грибы;
• бактерии;
• вирусы;
• паразиты и др.

Геном этих форм жизни также состоит в основном из ДНК или, в варианте некоторых вирусов, также из РНК (рибонуклеиновая кислота), которая, в отличие от ДНК — одноцепочечная. Поэтому в медицинской диагностике этот метод также проводится для уточнения многих инфекционных заболеваний:

• бактериальные инфекции, например, туберкулез, бактериальные венерические заболевания;
• вирусные инфекции, например, вирусный гепатит, ВИЧ-инфекция;
• паразитарные инфекции, например, малярия, и многое другое.

Компоненты полимеразной цепной реакции

ПЦР включает следующие компоненты:

• ДНК-матрица (образец дезоксирибонуклеиновой кислоты, с целевой последовательностью для амплификации);
• дезоксирибонуклеозидтрифосфаты;
• буфер;
• праймеры (прямые и обратные) – короткий сегмент нуклеотидов, комплементарный участку ДНК или РНК, необходимый для амплификации. В этой методике используются две короткие последовательности дезоксирибонуклеиновой кислоты, предназначенные для связывания с началом (прямой праймер) и концом (обратный праймер) последовательности – мишени.
• Taq-полимераза — термостабильная ДНК-полимераза, первоначально выделенная из термофильной бактерии Thermus aquaticus, сопротивляющаяся инактивации при температурах денатурации и позволяющая удлинять праймеры при высокой температуре.

Этапы полимеразной цепной реакции

Для проведения лабораторного исследования, извлеченный образец (содержащий шаблон ДНК-мишени) добавляют в пробирку, содержащую праймеры, свободные нуклеотиды (dNTP) и полимеразу Taq. Смесь помещают в лабораторное оборудование (термоциклер, ДНК-амплификатор) для проведения анализа. Термоциклер увеличивает и уменьшает температуру смеси для соответствующего анализа автоматическими запрограммированными шагами, экспоненциально генерирующими копии целевой последовательности.

Полимеразная цепная реакция включает три основных этапа:

1. Денатурация (разделение цепей). Разделение двух комплементарных цепей ДНК, связанных водородными связями, на пару одноцепочечных полинуклеотидных молекул в процессе нагревания (от 94C до 96C);
2. Отжиг (связывающий праймеры). Понижение температуры (45-60 C), для прикрепления праймеров к одноцепочечным цепям ДНК;
3. Удлинение (синтез новой ДНК). Начинается с отожженного праймера и проходит вдоль цепи ДНК (72C).

После завершения первого цикла процесс повторяется, возвращаясь к первичной температуре, и начинается следующий цикл денатурации, отжига и удлинения (автоматического процесса в термоциклере). Этому трехступенчатому температурному циклу предстоит повторяться около тридцати раз, что приведет к экспоненциальной амплификации последовательности целевого гена.

Поскольку этапы с первого по третий повторяются в несколько циклов, с каждым из них образуются вновь выстроенные цепи ДНК, отсюда и название этой лабораторной процедуры.

Анализ новообразованных цепочек ДНК

В конце, по завершении циклов цепной реакции, так называемые продукты ПЦР-анализа, то есть новообразованные молекулы ДНК, исследуют и оценивают качественно и количественно. Есть много вариантов этой оценки, в основном основанные на окрашивании (как правило, флуоресцентным красителем) ДНК и визуализации (с помощью гель-электрофореза или фотометрического флуоресцентного обнаружения).

Какие результаты анализов дает ПЦР

Результаты современных методов лабораторного исследования можно объединить в две группы:

• качественные результаты;
• количественные результаты.

Качественная методика выявляет, присутствует ли определенный участок генетического материала в исследуемом материале («положительный» результат) или нет («отрицательный» результат).

Таким образом, качественная ПЦР в основном используется для уточнения следующих диагностических вопросов (результаты «да/нет»):

• диагностика наследственных заболеваний;
• уточнение мутаций;
• распознавание генетических характеристик (например, предрасположенность к определенным заболеваниям) и т.д.

Количественная ПЦР — дальнейшее развитие лабораторной процедуры. С помощью нее выявляется не только наличие определенного участка генетического материала, но и количество генетического материала. Соответственно, количественная ПЦР используется для определения количества возбудителей в организме больного. При вирусных инфекциях эта процедура используется для выявления вирусной нагрузки.

Кроме того, количественная лабораторная оценка также имеет большое значение в фундаментальных исследованиях, благодаря чему эта диагностика приносит пользу не только медицине человека, но и ряду других научных областей: ветеринарии, биохимии, биологии и многим другим.

Преимущество этого анализа в диагностике инфекционных заболеваний состоит в том, что результаты лабораторной процедуры становятся доступны достаточно быстро (как правило, в течение одного рабочего дня). Кроме того, это тестирование считается высокочувствительным лабораторным методом. Это означает, что даже минимальное количество бактерий или вирусов в исследуемом материале приводит к достоверно положительному результату.

Наиболее важные области применения ПЦР

Что касается областей применения в области медицины человека, то этот лабораторный тест используется для решения следующих диагностических вопросов:

• Выявление наследственных заболеваний. Процедуры проводятся для диагностики большого количества наследственных заболеваний;
• Фармакогенетика. Исследуя генетические особенности метаболизма печени, можно сделать выводы об эффективности и дозировке препаратов.
• Онкологические заболевания. Метод используется, с одной стороны, для уточнения факторов риска некоторых опухолевых заболеваний (например, рака молочной железы). Однако, с другой стороны, клетки и ткани в уже возникших опухолях также можно исследовать на предмет различных мутаций, что играет все более важную роль в лечении этих заболеваний.
• Судебная медицина («судебная экспертиза»). В этом случае применение ПЦР тестирования имеет большое значение, например, в процедурах установления отцовства.
• Инфекционная медицина. ПЦР имеет огромное значение в диагностике и мониторинге течения и терапии бактериальных, вирусных и паразитарных инфекционных заболеваний.
• Секвенирование ДНК. Это процесс определения последовательности нуклеотидов (пар оснований) определенной последовательности ДНК. Клинически секвенирование используется для выявления патогенных мутаций у лиц с генетическими нарушениями, вызванными редкими вариантами в определенном локусе. Примером может служить повторное секвенирование локуса BRCA1 у лиц с риском семейного рака молочной железы. Текущее клиническое секвенирование основано на ПЦР, при этом каждый анализ фокусируется на определенном экзоне или области гена.
• Обнаружение редких последовательностей. Технология также позволяет обнаруживать редкие последовательности в популяции молекул ДНК или РНК. Это особенно полезно при поиске перестроек ДНК в условиях неоплазии. Примером может служить открытие того, что вирус, родственный Herpes simplex, участвует в патогенезе саркомы Капоши.

Продолжение статьи

• Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — все секреты популярного анализа — часть 1.
• Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — все секреты популярного анализа — часть 2.

: 21 Сен 2009 , Виват, Универ! , том 28,
№4

Часовые генома

Каждую секунду в клетках нашего тела возникает множество повреждений ДНК — число их измеряется квадриллионами. К счастью, лишь очень немногие из них приводят к последствиям в виде мутаций или возникновения раковых опухолей. Каким образом исправляется подавляющее большинство повреждений? Что происходит, когда системы их коррекции дают сбой? Об этом и о многом другом рассказывает эта статья

Эта история началась как в персидской поэме-сказке «Восемь райских садов» Амира Хосрова Дехлеви, написанной еще в XIV в. Жили некогда три брата-принца на острове Цейлон, именуемом тогда Серендипом. И была у них особенность – когда они что-то искали, то находили совершенно другое, но при этом еще более нужное. Почти пять столетий спустя это сказание прочел английский писатель Г. Уолпол и придумал слово serendipity. Считается, что оно входит в список десяти английских слов, самых трудных для перевода, но суть его понятна из легенды – это способность делать неожиданные удачные открытия «по случаю». Неудивительно, что именно в научном мире слово это употребляется особенно часто.

Вот так «по-серендипски» все и произошло… В 1946 г. А. Кельнер из знаменитой лаборатории молекулярной биологии в Колд-Спринг-Харборе занимался важным делом – искал новые антибиотики. Дело было сразу после войны, и успех пенициллина был у всех на слуху. Работая с бактериями стрептомицетами, Кельнер решил проверить, можно ли каким-то стрессовым воздействием заставить их вырабатывать больше нужного продукта. В качестве стрессового фактора он использовал облучение ультрафиолетом. Но вот беда – ему никак не удавалось подобрать нужную дозу облучения, при которой бактерии выживали. Данные по выживаемости стрептомицетов, оцененной по росту их колоний, «скакали» в зависимости от условий, в которых они находились после облучения.

К счастью, будучи очень аккуратным, Кельнер скрупулезно записывал мельчайшие детали своих экспериментов. Оказалось, что сразу после облучения выживаемость стрептомицетов была низкой. Ситуация не особенно улучшалась, если их затем держали какое-то время в темноте. А вот на свету выживаемость постепенно увеличивалась, и чем больше света – тем быстрее!

Молекула ДНК преставляет собой спираль, скрученную из двух цепочек. Цепочки состоят из последовательно соединенных нуклеотидов – азотистых оснований, присоединенных к остатку сахара-дезоксирибозы. В результате получается единый сахарофосфатный остов, на который навешаны основания четырех разных типов (аденин (А), гуанин (Г), тимин (Т) и цитозин (Ц)). Основания двух цепочек соединяются друг с другом водородными связями по принципу комплементарности (против А – Т, Ц – Г), что обеспечивает конструкции прочность. Вследствие действия негативных факторов различной природы могут повреждаться как отдельные основания, так и целые нуклеотиды и сахарофосфатный остов

Перепроверка всех результатов заняла у Кельнера три года. А тем временем инактивацию ультрафиолетом бактериофагов (вирусов бактерий) изучал Р. Дульбекко, будущий нобелевский лауреат (в то время он был молодым научным сотрудником в группе С. Лурии, тоже будущего нобелевского лауреата). Ученый пришел точно к таким же выводам, как и Кельнер.

Удивительное совпадение: когда Кельнер написал статью о своих результатах, он послал ее именно Лурии для прочтения и критики. К чести Дульбекко и Лурии, они не стали зажимать работу конкурента, а, напротив, поделились с ним своими достижениями. Статьи обоих ученых вышли в одно и то же время. В общем-то, уже тогда было известно, что ультрафиолет повреждает генетический материал клетки. Результаты исследований свидетельствовали, что видимый свет помогает ему восстанавливаться. Этот процесс назвали фотореактивацией.

Вот так, совершенно случайно и «попутно» было сделано открытие процесса репарации ДНК, не менее важного, чем широко известные другие молекулярно-генетические процессы репликации, транскрипции и трансляции генетического материала. История принцев Серендипа в очередной раз повторилась…

Зачем это нужно?

Как известно, ДНК состоит из азотистых оснований четырех разных типов и сахарофосфатного остова, образующего непрерывную цепочку, на которую эти основания навешены. Повреждаться могут как основания, так и остов. Всего насчитывают около сотни возможных различных повреждений, механизмы возникновения которых также различаются.

Например, при дезаминировании (отщеплении аминогруппы NH₂) из обычного для ДНК основания цитозина возникает урацил, в норме встречающийся только в РНК. Основания ДНК могут подвергаться окислению. К некоторым позициям в основаниях охотно присоединяются другие углеродсодержащие группы – происходит алкилирование. Под влиянием ультрафиолетового света соседние тимины могут сшиваться друг с другом, образуя димеры. Очень часто основания отрываются от остова ДНК: так возникают АП-сайты. А ионизирующая радиация приводит к появлению в цепи ДНК одно- или двухцепочечных разрывов.

Повреждения ДНК, особенно если их много, могут вызывать не только мутации, но и гибель клетки. Тут необходимо отметить, что повреждение ДНК и мутация – не одно и то же. Чтобы повреждение превратилось в мутацию, нужно, чтобы произошла репликация – синтез новой цепочки ДНК на матрице «старой». Обычно при репликации соблюдается принцип комплементарности. Однако если в матрице есть поврежденное звено, то напротив него в дочернюю цепь включится совсем не то, что нужно.

Например, напротив АП-сайта может включиться в принципе все, что угодно – ведь на матрице нет основания-подсказки. Вот так и возникнет мутация, т. е. отклонение последовательности ДНК от исходной. Мутации в половых клетках передаются следующему поколению, а в остальных клетках организма могут приводить к раку. Как полагают сейчас многие ученые, и самая неизлечимая «болезнь» – старение – тоже тесно связана с накоплением мутаций в клетках нашего тела.

Кстати сказать, еще одним источником появления ошибок в ДНК служит неправильное включение нуклеотидов при самой репликации. Ферменты ДНК-полимеразы делают такие ошибки с частотой примерно 0,001—0,00001. Частично полимеразы могут сами исправлять свои ошибки, сразу вырезая неправильно включенное звено, что повышает их надежность еще в 100—1000 раз. Однако даже такая точность соответствует десяткам или даже сотням ошибок, которые возникают в каждой нашей клетке при ее делении.

Все ошибки, возникшие в нуклеотидной последовательности ДНК, необходимо исправлять. Поэтому в процессе эволюции возникли несколько систем, известных под общим названием «системы репарации ДНК», защищающие нас от мутаций, вызванных повреждениями наследственного материала. Дать их даже очень схематичное описание в небольшой статье – задача практически невыполнимая. А полное их описание в главном талмуде ученых-репарационщиков – книге Э. Фридберга «Мутагенез и репарация ДНК» (2006 г.) – занимает полторы тысячи страниц убористого текста. Тем не менее получить общее представление о работе этих систем вполне возможно.

Врачу, исцелися сам!

При штатной работе систем репарации наш геном вполне стабилен. Однако, как и в любой достаточно сложной схеме, у них есть свои слабые точки, неполадки в которых приводят к сбою всего механизма.

Гены, кодирующие белки репарации, ничем не отличаются от других генов – в них тоже могут происходить мутации. Если такая мутация не позволяет белку нормально функционировать, соответствующий путь репарации отключается. Тогда в организме проявляется так называемый мутаторный фенотип, в котором новые мутации появляются гораздо легче, со всеми вытекающими отсюда неприятными последствиями. Дефекты определенных генов репарации проявляются как наследственные болезни, для которых обычно повышен риск возникновения рака, но вообще их проявления могут быть достаточно разнообразны.

РЕМОНТНАЯ МАСТЕРСКАЯ ДНК: УЧИМ МАТЧАСТЬ

На сегодняшний день известно шесть разных механизмов репарации (ремонта) ДНК, которые работают независимо, но иногда могут и взаимодействовать. Еще одна ремонтная система не восстанавливает поврежденную ДНК, но помогает клетке выжить

РЕАКТИВАЦИЯ

Этот процесс идет с помощью одного специфичного белка-фермента, предназначенного для исправления только определенного повреждения. Среди них есть ферменты-самоубийцы, способные катализировать только одну реакцию, т. е. исправить одну «ошибку». При этом их структура меняется, и работать дальше они не могут

ЭКСЦИЗИОННАЯ РЕПАРАЦИЯ ОСНОВАНИЙ

По этому пути происходит репарация небольших поврежденных оснований, не вносящих значительных искажений в структуру ДНК. Сначала такое основание узнается ДНК-гликозилазами, которые вырезают его из ДНК. Таких ферментов более десятка, и каждый из них удаляет только определенные поврежденные основания. После этого в ДНК остается «пустое место» (АП-сайт), в которую в конечном счете встраивается «правильное» основание

ЭКСЦИЗИОННАЯ РЕПАРАЦИЯ НУКЛЕОТИДОВ

РЕПАРАЦИЯ ГЕТЕРОДУПЛЕКСОВ

ВОССОЕДИНЕНИЕ НЕГОМОЛОГИЧНЫХ КОНЦОВ

ГОМОЛОГИЧНАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ

Этот довольно сложный процесс позволяет «заштопать» двуцепочечные разрывы безошибочно. Для этого используется неповрежденная копия той же самой последовательности, например, во второй хромосоме из диплоидного набора. Подробно описать процесс затруднительно: в нем принимают участие много ферментов, а нити ДНК тасуются туда-сюда, как карты в руках искусного фокусника

ТРАНСЛЕЗИОННЫЙ СИНТЕЗ

Пожалуй, самая известная и хорошо изученная из таких болезней – пигментная ксеродерма. Она даже оставила следы в художественной литературе: любители триллеров Д. Кунца могут вспомнить, что именно ей страдает детектив-любитель Кристофер Сноу, главный герой цикла «Лунная бухта». На самом деле это даже не одно заболевание, а целых восемь, но с довольно схожими проявлениями. Большая часть случаев связана с неисправностями системы эксцизионной репарации нуклеотидов (недостатком любого из семи белков XPA–XPG, в ней участвующих) либо белка XPV, который представляет собой ДНК-полимеразу, участвующую в транслезионном синтезе.

Фотографиями людей, больных пигментной ксеродермой, специалисты по репарации любят пугать аудиторию на лекциях или научных конференциях. Главный признак болезни – тяжелые ожоги, остающиеся на коже после самого непродолжительного пребывания на солнце. После ожогов быстро появляются пигментные пятна, кожа сохнет и растрескивается, а кончается все раком кожи, который развивается примерно к 7—8 годам. Поражаются и глаза, которые очень болезненно реагируют на солнечный свет. Менее половины больных пигментной ксеродермой доживают до 20 лет. Хорошо, что болезнь эта встречается довольно редко: среди европейцев – примерно у 4 человек из миллиона. А вот у японцев частота встречаемости пигментной ксеродермы в шесть раз выше.

Внимание ученых эта болезнь привлекает в том числе и своей многоликостью. Нечасто бывает, что повреждение одного и того же гена вызывает разные заболевания, но в данном случае дела обстоят именно так. Причина в том, что один и тот же белок может входить в состав разных белковых комплексов, выполняющих в клетке разные функции. И одна мутация может нарушать только способность белка работать в одних комплексах, в других же он будет вполне работоспособен.

Например, некоторые мутации в гене, кодирующем репарационный белок XPD, вызывают типичную ксеродерму, а другие мутации в том же гене – совершенно другую болезнь, синдром Кокейн, при которой в первые два года жизни начинаются проблемы с ростом и развитием. В результате у таких детей развивается карликовость и истощение, а лицо приобретает характерную «птичью» форму – ввалившиеся глаза и выдающийся нос. Разрушаются оболочки нервных волокон, многие нейроны отмирают, в сосудах головного мозга откладываются соли кальция – создается впечатление, что нервная система при этом синдроме стареет намного быстрее остального организма. Средняя продолжительность жизни таких больных еще меньше – около 12 лет.

А еще мутация в том же самом гене может вызывать и третью болезнь – трихотиодистрофию, при которой репарация ДНК происходит практически нормально, но при этом в организме нарушается синтез некоторых белков-кератинов. Результат – ломкие волосы, чешуйчатая кожа и почти полное отсутствие жировой ткани на лице.

Всего насчитывают несколько десятков наследственных заболеваний, связанных с неисправностями систем репарации. По большей части такие болезни, как и следовало ожидать для мутаторного фенотипа, отличаются повышенным риском развития рака и зачастую – ускоренным старением.

В частности, синдром Вернера, при котором не работает одна из ферментов-геликаз репарации, практически точно воспроизводит картину нормального старения. Вот только обычный срок человеческой жизни при этом сжат до 30—50 лет… А еще дефекты репарации часто проявляются в нейродегенеративных заболеваниях. Все знают, что «нервные клетки не восстанавливаются», и хотя это на самом деле не совсем так, но все же типичный нейрон действительно должен служить человеку всю жизнь. А за это время в его ДНК возникает множество повреждений.

Крем с ферментами

Разумеется, такие мощные и специфичные защитные средства, как ферменты репарации, не могли пройти мимо внимания медиков. Хорошо было бы научиться использовать их для предохранения нашего генома от повреждений! Теоретически это возможно, но есть огромная проблема: пока что никто не придумал способа, с помощью которого молекулы белка, используемые в качестве лекарства, могли бы проникать во все клетки тела. Более того, белки вообще плохо проникают в клетки – для этого приходится использовать всяческие ухищрения. Например, их можно запаковать в специальные мембранные пузырьки – липосомы, которые будут сливаться с клеточными мембранами и высвобождать свое содержимое внутрь клетки.

Однако этим способом пока можно доставить терапевтические ферменты не во все ткани, а лишь в такие легкодоступные места, как кожа. Тут ферменты репарации действительно уже нашли применение в медицине – ведь кожа, частенько находящаяся под действием солнечного света, принадлежит к числу органов, больше всего страдающих от генотоксического стресса.

Американская компания AGI Dermatics выпускает кремы с липосомами, содержащими фотолиазу и эндонуклеазу V – два фермента, участвующие в репарации циклобутановых димеров, образующихся в ДНК под действием ультрафиолета. Небольшая баночка крема стоит около сотни долларов, и, по уверениям фирмы, ее продукт работает гораздо лучше обычных защитных кремов. Возможно, это действительно так: в отличие от большинства косметических продуктов, которые никогда не проходили жесткого тестирования, обязательного для лекарств, липосомы AGI Dermatics сейчас находятся на последней стадии клинических испытаний по профилактике рака кожи, в том числе и у больных пигментной ксеродермой.

По-видимому, использование ферментов репарации для предохранения барьерных тканей (кожи и слизистых оболочек) от генотоксического стресса имеет большое будущее. Уже сейчас ДНК-гликозилазы, исправляющие окислительные повреждения ДНК, испытываются (пока на животных) в качестве средств для предупреждения рака легких – органа, подвергающегося самой массированной атаке кислородными радикалами.

Репарацию у врага – подавить!

Итак, если у нас работают системы репарации – это хорошо. Плохо, когда они работают у наших врагов – болезнетворнх бактерий, вирусов и опухолевых клеток. Можно ли каким-то образом на них воздействовать, подавив в них репарацию? Такие примеры уже имеются.

Проще всего, как ни странно, оказалось использовать системы репарации в качестве мишени для лекарств при онкологических заболеваниях. Как известно, очень многие химиопрепараты действуют, повреждая ДНК раковой клетки. При этом эти повреждения, разумеется, подвергаются репарации, что снижает эффективность действия лекарств. Поэтому ингибирование репарации рассматривается сейчас как перспективный метод усиления действенности химиотерапии. Например, на последней стадии клинических испытаний находится бензилгуанин – ингибитор фермента-самоубийцы MGMT, который «ремонтирует» алкилированные основания ДНК и тем самым мешает работе таких широко применяемых противоопухолевых агентов, как кармустин и темозоломид.

Ингибиторы репарации для борьбы с бактериями и вирусами существуют пока только в проекте. Однако известно, что некоторые вирусы, например поксвирусы (в том числе вирус натуральной оспы), герпесвирусы (вирусы простого герпеса и ветряной оспы) и лентивирусы (ВИЧ), нуждаются для своего размножения в репарационном ферменте урацил-ДНК-гликозилазе, либо собственной, либо заимствованной у хозяина. Ингибиторы этого фермента также уже испытываются как противовирусные лекарства.

Что касается болезнетворных бактерий, то наши иммунные клетки-макрофаги при встрече с ними пытаются убить интервентов «окислительным взрывом», выбрасывая огромное количество кислородных и азотных радикалов, повреждающих бактериальную ДНК. Только мощная система репарации помогает бактериям выжить в таком столкновении; если ее удастся подавить, собственным защитникам человеческого организма будет легче справиться с инфекцией.

ДНК, как здоровье?

То, что повреждение ДНК может доставить массу неприятностей – понятно. А есть ли способ как-то оценить «здоровье» ДНК, померить, сколько в ней «ошибок»? Это очень важно, например, для оценки потенциальной степени мутагенности окружающей среды, влияния нового лекарства на человеческий организм, да мало ли еще для чего…

Один такой способ изобрел в 1988 г. Нарендра Сингх из американского Национального института старения. Речь идет о кометографии, или методе кометного хвоста. В самом простом варианте при этом измеряется число двухцепочечных разрывов в ДНК. Отдельные клетки (например, лейкоциты крови) заплавляют в агарозную плашку, разрушают их оболочку особыми реагентами и помещают в электрическое поле – ведут знакомый всем биохимикам электрофорез. Молекула ДНК, заряженная отрицательно, движется к аноду. Но так как она очень длинная, то с места почти не сдвигается. Но если в ДНК есть разрывы, то более короткие фрагменты быстро «убегают», за ними тянутся более длинные и т. д. Так что если окрасить ДНК специальными красителями, то будет видна характерная фигура – «кометный хвост». Чем хвост длиннее, тем больше в ДНК коротких фрагментов, тем больше разрывов и тем сильнее она повреждена.

С момента изобретения кометографии придумали множество ее разновидностей для обнаружения разных видов повреждений. Например, если вести электрофорез в щелочных условиях, то двойная спираль ДНК разделяется на отдельные цепочки. В результате можно увидеть не только двухцепочечные, но и одноцепочечные разрывы и даже АП-сайты. А если всю плашку предварительно хорошенько замочить в растворе, содержащем какую-нибудь ДНК-гликозилазу, то можно будет установить, сколько в ДНК было поврежденных оснований, которые этот фермент вырезает.

Помимо совершенствования методов кометографии постоянно ищутся и новые объекты. Например, несколько лет назад немецкие исследователи предложили для оценки состояния природных водоемов проводить кометографию на пресноводных губках, которые легко «разобрать» на отдельные клетки. Немцы даже приезжали на Байкал, собрали там губки и удостоверились, что байкальская вода генам на пользу.

Легко и быстро оценивать генотоксичность внешней среды помогает система, основанная на SOS-ответе бактерий. Известно, что некоторые бактериальные гены, в том числе гены репарации, включаются только при повреждении ДНК. В начале всех таких генов есть специальный регуляторный элемент – SOS-бокс. Если под него вместо штатного гена подставить какой-нибудь репортерный элемент (например, ген, кодирующий излюбленный биохимиками зеленый флуоресцентный белок), то в условиях, повреждающих ДНК, бактерия будет давать соответствующий цветной сигнал. Таким образом, светящиеся бактерии будут свидетельствовать об опасности для человеческих генов.

Сегодня насчитывается несколько десятков кон­струкций подобных биосенсоров – некоторые посылали даже в космос для исследования повреждающего действия космических лучей.

Практически закончив писать эту статью, автор зашел в базу данных PubMed, где собраны аннотации почти всех статей по биомедицинской тематике, когда-либо выходивших в мире.

Беглый поиск выдал 33 646 публикаций по тематике «репарация ДНК». Почти все новые «горячие» направления в биологии так или иначе пересекаются с репарацией – есть работы и по репарации в стволовых клетках, и по генотоксичности наночастиц… Как видно, интерес к этой теме огромен, и он будет только расти, ведь безопасность личного генома волнует нас всех.

И, будем надеяться, чудесная особенность принцев Серендипа, с которой началась история открытия репарации ДНК, еще не раз послужит ученым, работающим в этой области.

Литература

Жарков Д. О. Загадки «ржавой» ДНК // Наука из первых рук. – 2006. –№ 6. – С. 24—35.

Ходырева С. Н., Лаврик О. И. Как клетка ремонтирует ДНК // Наука из первых рук. – 2007. –№ 3. – С. 82—89.

Автор и редакция благодарят К. Баумштарк-Хан (Институт аэрокосмической биологии, Германия) за помощь в подготовке иллюстраций

: 21 Сен 2009 , Виват, Универ! , том 28,
№4

Многие методы исследования в области молекулярной биологии требуют миллионов идентичных копий чистой ДНК. Полимеразная цепная реакция — это молекулярный метод, имитирующий процесс репликации дезоксирибонуклеиновой кислоты для амплификации определенных сегментов ДНК in vitro. Реакция повторяется через серию изменений температуры, во время которых нити ДНК разделяются, праймеры связываются и образуются комплементарные нити.

Эволюция ДНК-полимераз                                                                 

Прогресс в ПЦР был бы невозможен без эволюции ДНК-полимераз — специализированных ферментов. 

История современной ПЦР началась в 1976 году с выделения ДНК-полимеразы Taq из термофильной бактерии Thermus aquaticus. Выявление бактерии означало, что у молекулярных биологов появился термостабильный фермент, способный к повторному циклу ПЦР без необходимости добавления свежей ДНК-полимеразы после каждого цикла.

Однако влияние, которое фермент Taq окажет на молекулярную биологию, не был ясен до 1988 года, пока фермент не коммерциализировали для широкого использования. ДНК-полимераза Taq имела мгновенный успех, и в 1989 г. даже была названа журналом Science «Молекулой года».

Хотя эти разработки представляли собой значительный прогресс, ДНК-полимераза Taq не была идеальной. Анализ с ее использованием был нестабилен при высоких температурах и подвержен ошибкам. Эти факторы сыграли роль в задержке развития возможностей ПЦР на раннем этапе, особенно в приложениях, требующих высокой специфичности и надежности. Вскоре стало очевидно, что разработка ДНК-полимераз неразрывно связана с эффективным использованием ПЦР, и что для увеличения мощности ПЦР и открытия более широкого спектра возможностей анализа необходимо разработать более совершенные ДНК-полимеразы.

В конце 1980-х годов появился ряд методов с использованием «горячего старта», помогающих преодолеть неэффективность и низкую специфичность ДНК-полимеразы Taq при высоких температурах. Эти методы заключались в нагревании образцов до 95°C и последующем охлаждении до 60–70°C перед добавлением полимеразы. Несмотря на эффективность, методы горячего старта отнимали много времени и часто вызывали перекрестное загрязнение проб. ПЦР требовалось долгосрочное решение.

В 1991 г. были выделены и разработаны полимеразы Pfu, полученные из гипертермофильных архей Pyrococcus furiosus. ДНК-полимераза Pfu, в отличие от ДНК-полимеразы Taq, имеет встроенную корректирующую активность экзонуклеазы от 3 ‘до 5’, что означает, что она может исправлять ошибки включения нуклеотидов, значительно снижать частоту ошибок и обеспечивать повышенную специфичность. Разработка и использование как полимераз Pfu, так и Taq продолжались в течение некоторого времени, при этом ПЦР сыграла важную роль в ряде новаторских исследований, таких как секвенирование.

Внедрение слитых ДНК-полимераз в 2003 году, стало первым шагом в разработке полимераз нового поколения и ПЦР высокой точности. Эти специально сконструированные ДНК-полимеразы могли преодолеть или уменьшить многие проблемы, все еще ограничивающие развитие ПЦР. Созданные путем слияния основных компонентов архебактериальной полимеразы с термостабильным ДНК-связывающим доменом, первые ДНК-полимеразы Phusion High Fidelity обладали сильной корректирующей способностью и были невероятно стабильны при высоких температурах реакции. Кроме того, при использовании специализированного ДНК-связывающего домена сродство полимеразы к двухцепочечной ДНК увеличивалось в геометрической прогрессии.

Разработка полимераз следующего поколения наряду с развитием технологий ПЦР в реальном времени и цифровой ПЦР гарантировала, что ПЦР будет играть важную роль в будущих исследованиях в области наук о жизни и здравоохранении.

Что такое полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — важнейший лабораторный метод исследования тонкой молекулярной структуры генетического материала. Он состоит из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), составляющей генетический код человека, а также животных и растений.

В медицине анализ используется для уточнения наследственных заболеваний и генетических проблем (риск заболевания, тест на отцовство и т. д.), а также для диагностики многих инфекционных заболеваний. В отличие от серологической диагностики (определение антител к возбудителям в крови) способы полимеразной цепной реакции представляют собой прямой лабораторно-медицинский метод выявления в рамках уточнения инфекционных заболеваний.

Преимущество этого способа диагностики — быстрая доступность результатов. Кроме того, методы полимеразной цепной реакции обладают очень высокой чувствительностью. Это означает, что даже минимальное количество генетического материала от возбудителя (бактерии, вирусы и т. д.) приводит к достоверно положительному результату при наличии соответствующего патогена в нужном исследуемом материале. 

Кровь — основной исследуемый материал для этого метода, однако используются и другие биологические жидкости (мокрота, моча, ликвор и т. д.). В основе генетического материала лежит особая длинноцепочечная молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты.

У людей генетический материал, состоящий из двухцепочечной ДНК (две комплементарные нити), находится в ядре всех клеток организма, при этом они имеют идентичный генетический материал. Кроме того, индивидуальный геном каждого человека уникален по своему точному составу и сравним с отпечатком пальца, также уникального для каждого человека.

По этой причине генетический материал также называют «генетический код». В этой форме закодирована схема всех структур человеческого организма, таким образом она сохраняется и в дальнейшем может передаваться по наследству.

В ядрах клеток тела дезоксирибонуклеиновая кислота присутствует в особом порядке, известном как хромосомы (наследственные клетки). У людей они всегда встречаются парами, причём, одна наследуется от матери, а другая — от отца. Все клетки человеческого тела содержат в общей сложности 46 хромосом — 22 пары, называемые аутосомами, и одну пару, называемую половыми хромосомами.

Лабораторная процедура может быть использована для исследования тонкой структуры генетического кода человека, что важно при диагностике заболеваний или уточнении конкретных вопросов:

• выявление наследственных заболеваний;
• оценка риска заболевания;
• исследование врожденных особенностей обмена веществ;
• судебно-медицинская (так называемая «криминалистическая») экспертиза.

Не только люди, но и фактически все формы жизни на Земле имеют определенный генетический материал:

• грибы;
• бактерии;
• вирусы;
• паразиты и др.

Геном этих форм жизни также состоит в основном из ДНК или, в варианте некоторых вирусов, также из РНК (рибонуклеиновая кислота), которая, в отличие от ДНК — одноцепочечная. Поэтому в медицинской диагностике этот метод также проводится для уточнения многих инфекционных заболеваний:

• бактериальные инфекции, например, туберкулез, бактериальные венерические заболевания;
• вирусные инфекции, например, вирусный гепатит, ВИЧ-инфекция;
• паразитарные инфекции, например, малярия, и многое другое.

Компоненты полимеразной цепной реакции

ПЦР включает следующие компоненты:

• ДНК-матрица (образец дезоксирибонуклеиновой кислоты, с целевой последовательностью для амплификации);
• дезоксирибонуклеозидтрифосфаты;
• буфер;
• праймеры (прямые и обратные) – короткий сегмент нуклеотидов, комплементарный участку ДНК или РНК, необходимый для амплификации. В этой методике используются две короткие последовательности дезоксирибонуклеиновой кислоты, предназначенные для связывания с началом (прямой праймер) и концом (обратный праймер) последовательности – мишени.
• Taq-полимераза — термостабильная ДНК-полимераза, первоначально выделенная из термофильной бактерии Thermus aquaticus, сопротивляющаяся инактивации при температурах денатурации и позволяющая удлинять праймеры при высокой температуре.

Этапы полимеразной цепной реакции

Для проведения лабораторного исследования, извлеченный образец (содержащий шаблон ДНК-мишени) добавляют в пробирку, содержащую праймеры, свободные нуклеотиды (dNTP) и полимеразу Taq. Смесь помещают в лабораторное оборудование (термоциклер, ДНК-амплификатор) для проведения анализа. Термоциклер увеличивает и уменьшает температуру смеси для соответствующего анализа автоматическими запрограммированными шагами, экспоненциально генерирующими копии целевой последовательности.

Полимеразная цепная реакция включает три основных этапа:

1. Денатурация (разделение цепей). Разделение двух комплементарных цепей ДНК, связанных водородными связями, на пару одноцепочечных полинуклеотидных молекул в процессе нагревания (от 94C до 96C);
2. Отжиг (связывающий праймеры). Понижение температуры (45-60 C), для прикрепления праймеров к одноцепочечным цепям ДНК;
3. Удлинение (синтез новой ДНК). Начинается с отожженного праймера и проходит вдоль цепи ДНК (72C).

После завершения первого цикла процесс повторяется, возвращаясь к первичной температуре, и начинается следующий цикл денатурации, отжига и удлинения (автоматического процесса в термоциклере). Этому трехступенчатому температурному циклу предстоит повторяться около тридцати раз, что приведет к экспоненциальной амплификации последовательности целевого гена.

Поскольку этапы с первого по третий повторяются в несколько циклов, с каждым из них образуются вновь выстроенные цепи ДНК, отсюда и название этой лабораторной процедуры.

Анализ новообразованных цепочек ДНК

В конце, по завершении циклов цепной реакции, так называемые продукты ПЦР-анализа, то есть новообразованные молекулы ДНК, исследуют и оценивают качественно и количественно. Есть много вариантов этой оценки, в основном основанные на окрашивании (как правило, флуоресцентным красителем) ДНК и визуализации (с помощью гель-электрофореза или фотометрического флуоресцентного обнаружения).

Какие результаты анализов дает ПЦР

Результаты современных методов лабораторного исследования можно объединить в две группы:

• качественные результаты;
• количественные результаты.

Качественная методика выявляет, присутствует ли определенный участок генетического материала в исследуемом материале («положительный» результат) или нет («отрицательный» результат).

Таким образом, качественная ПЦР в основном используется для уточнения следующих диагностических вопросов (результаты «да/нет»):

• диагностика наследственных заболеваний;
• уточнение мутаций;
• распознавание генетических характеристик (например, предрасположенность к определенным заболеваниям) и т.д.

Количественная ПЦР — дальнейшее развитие лабораторной процедуры. С помощью нее выявляется не только наличие определенного участка генетического материала, но и количество генетического материала. Соответственно, количественная ПЦР используется для определения количества возбудителей в организме больного. При вирусных инфекциях эта процедура используется для выявления вирусной нагрузки.

Кроме того, количественная лабораторная оценка также имеет большое значение в фундаментальных исследованиях, благодаря чему эта диагностика приносит пользу не только медицине человека, но и ряду других научных областей: ветеринарии, биохимии, биологии и многим другим.

Преимущество этого анализа в диагностике инфекционных заболеваний состоит в том, что результаты лабораторной процедуры становятся доступны достаточно быстро (как правило, в течение одного рабочего дня). Кроме того, это тестирование считается высокочувствительным лабораторным методом. Это означает, что даже минимальное количество бактерий или вирусов в исследуемом материале приводит к достоверно положительному результату.

Наиболее важные области применения ПЦР

Что касается областей применения в области медицины человека, то этот лабораторный тест используется для решения следующих диагностических вопросов:

• Выявление наследственных заболеваний. Процедуры проводятся для диагностики большого количества наследственных заболеваний;
• Фармакогенетика. Исследуя генетические особенности метаболизма печени, можно сделать выводы об эффективности и дозировке препаратов.
• Онкологические заболевания. Метод используется, с одной стороны, для уточнения факторов риска некоторых опухолевых заболеваний (например, рака молочной железы). Однако, с другой стороны, клетки и ткани в уже возникших опухолях также можно исследовать на предмет различных мутаций, что играет все более важную роль в лечении этих заболеваний.
• Судебная медицина («судебная экспертиза»). В этом случае применение ПЦР тестирования имеет большое значение, например, в процедурах установления отцовства.
• Инфекционная медицина. ПЦР имеет огромное значение в диагностике и мониторинге течения и терапии бактериальных, вирусных и паразитарных инфекционных заболеваний.
• Секвенирование ДНК. Это процесс определения последовательности нуклеотидов (пар оснований) определенной последовательности ДНК. Клинически секвенирование используется для выявления патогенных мутаций у лиц с генетическими нарушениями, вызванными редкими вариантами в определенном локусе. Примером может служить повторное секвенирование локуса BRCA1 у лиц с риском семейного рака молочной железы. Текущее клиническое секвенирование основано на ПЦР, при этом каждый анализ фокусируется на определенном экзоне или области гена.
• Обнаружение редких последовательностей. Технология также позволяет обнаруживать редкие последовательности в популяции молекул ДНК или РНК. Это особенно полезно при поиске перестроек ДНК в условиях неоплазии. Примером может служить открытие того, что вирус, родственный Herpes simplex, участвует в патогенезе саркомы Капоши.

Продолжение статьи

• Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — все секреты популярного анализа — часть 1.
• Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — все секреты популярного анализа — часть 2.

ДНК-полимераза I, термостабильная
Большой (кленовский) фрагмент Taq polA, содержащий polA и рудиментарные домены
Идентификаторы
Организм	Thermus aquaticus
Символ	ПОЛЬША
UniProt	P19821
Ищи Структуры Швейцарская модель Домены ИнтерПро

Taq полимераза термостабильный ДНК-полимераза I названный в честь теплолюбивый эубактериальный микроорганизм Thermus aquaticus, из которого он был первоначально выделен Chien et al. в 1976 г.^[1] Его название часто сокращается до Taq или же Taq pol. Часто используется в полимеразной цепной реакции (ПЦР), метод значительного увеличения количества коротких сегментов ДНК.

T. aquaticus это бактерия что живет в горячие источники и гидротермальные источники, и Taq полимераза была идентифицирована^[1] как фермент способен выдерживать денатурирующие белок условия (высокая температура), необходимые во время ПЦР.^[2] Поэтому он заменил ДНК-полимеразу из Кишечная палочка изначально использовался в ПЦР.^[3]

Ферментативные свойства

Taq ‘оптимальная температура для Мероприятия 75–80 ° C, при период полураспада более 2 часов при 92,5 ° C, 40 минут при 95 ° C и 9 минут при 97,5 ° C, и может повторить 1000 базовая пара цепь ДНК менее чем за 10 секунд при 72 ° C.^[4] При 75-80 ° C, Taq достигает оптимального полимеризация скорость около 150 нуклеотиды в секунду на молекулу фермента, и любые отклонения от оптимального температурного диапазона ингибируют скорость удлинения фермента. Один Taq синтезирует около 60 нуклеотидов в секунду при 70 ° C, 24 нуклеотидов / сек при 55 ° C, 1,5 нуклеотидов / сек при 37 ° C и 0,25 нуклеотидов / сек при 22 ° C. При температуре выше 90 ° C, Taq проявляет очень небольшую активность или вообще не проявляет активности, но сам фермент не денатурирует и остается нетронутым.^[5] Наличие определенных ионы в реакционном сосуде также влияет удельная активность фермента. Небольшие количества хлорид калия (KCl) и магний ион (Mg²⁺) продвигать Taqферментативная активность. Taq полимераза максимально активируется при 50 мМ KCl и правильной концентрации Mg²⁺ что определяется концентрацией нуклеозидтрифосфаты (дНТФ). Высокие концентрации KCl и Mg²⁺ подавлять Taqактивность.^[6] Интересно, что обычный хелатор ионов металлов, EDTA, напрямую связывается с Taq в отсутствие этих ионов металлов.^[7]

Один из Taq ‘недостатком является отсутствие 3′ к 5′ экзонуклеаза корректура Мероприятия^[4] что приводит к относительно низкой точности репликации. Первоначально частота ошибок составляла примерно 1 из 9000 нуклеотидов.^[8] Некоторые термостабильные ДНК-полимеразы были выделены из других термофильных бактерий и архей, таких как Pfu ДНК-полимераза, занимающихся корректурой, и используются вместо (или в сочетании с) Taq для высококачественного усиления.^[9] Верность может сильно различаться между Taq, оказывая огромное влияние на последующие приложения секвенирования.^[10]

Taq производит продукты ДНК, содержащие A (аденин ) выступы на концах 3 ‘. Это может быть полезно в Клонирование ТА, посредством чего клонирование вектор (например, плазмида ), имеющий T (тимин ) 3 ‘выступ, который дополняет выступ A продукта ПЦР, что позволяет перевязка продукта ПЦР в плазмидный вектор.

В ПЦР

В начале 1980-х гг. Кэри Маллис работал на Cetus Corporation о применении синтетических ДНК для биотехнология. Он был знаком с использованием ДНК олигонуклеотиды в качестве зондов для связывания с целевыми цепями ДНК, а также их использование в качестве грунтовки за Секвенирование ДНК и кДНК синтез. В 1983 году он начал использовать два праймера, один для гибридизировать к каждой цепи целевой ДНК и добавив ДНК-полимераза на реакцию. Это привело к экспоненциальному Репликация ДНК,^[11] значительно усиливают дискретные сегменты ДНК между праймерами.^[3]

Однако после каждого цикла репликации смесь необходимо нагреть выше 90 ° C до денатурировать вновь сформированная ДНК, позволяющая цепям разделиться и действовать как матрица в следующем раунде амплификации. Эта стадия нагрева также инактивирует ДНК-полимеразу, которая использовалась до открытия Taq полимераза, Кленовский фрагмент (получено из Кишечная палочка ). Taq Полимераза хорошо подходит для этого применения, потому что она способна выдерживать температуру 95 ° C, которая требуется для разделения цепей ДНК без денатурации.

Использование термостабильного Taq позволяет проводить ПЦР при высокой температуре (~ 60 ° C и выше), что способствует высокой специфичности праймеров и снижает производство неспецифических продуктов, таких как димер праймера. Кроме того, использование термостабильной полимеразы избавляет от необходимости добавлять новый фермент в каждый цикл термоциклирования. Одиночная закрытая труба в относительно простой машина можно использовать для выполнения всего процесса. Таким образом, использование Taq полимераза была ключевой идеей, которая сделала ПЦР применимой к большому разнообразию молекулярная биология проблемы, касающиеся анализа ДНК.^[2]

Патентные вопросы

Hoffmann-La Roche в итоге купил ПЦР и Taq патенты от Cetus за 330 миллионов долларов, из которых он мог получить до 2 миллиардов долларов роялти.^[12] В 1989 г. Научный журнал названный Taq полимераза его первая «Молекула года «. Кэри Муллис получила Нобелевская премия по химии в 1993 г. — единственная награда за исследования, выполненные в биотехнология Компания. К началу 1990-х годов техника ПЦР с Taq полимераза используется во многих областях, включая фундаментальные исследования молекулярной биологии, клинические испытания, и криминалистика. Он также начал находить неотложное применение в прямом обнаружении ВИЧ в СПИД.^[13]

В декабре 1999 г. окружной судья США Вон Уокер постановил, что патент 1990 г. Taq Полимераза была частично выпущена на основании вводящей в заблуждение информации и ложных утверждений ученых с Cetus Corporation. Решение поддержало вызов Корпорация Промега против Хоффман-Ла Рош, который приобрел Taq патентов в 1991 году. Судья Уокер сослался на предыдущие открытия, сделанные другими лабораториями, включая лабораторию профессора Джон Трела в Университет Цинциннати отдел биологических наук, как основание для постановления.^[14]

Структура домена

Полимераза Taq, экзонуклеаза
Полный Taq ДНК-полимераза, связанная с октамером ДНК
Идентификаторы
Символ	Taq-exonuc
Pfam	PF09281
ИнтерПро	IPR015361
SCOP2	1qtm / Объем / СУПФАМ
Доступные белковые структуры: Pfam   структуры / ECOD   PDB RCSB PDB; PDBe; PDBj PDBsum резюме структуры

Taq PolA имеет общую структуру, аналогичную структуре Кишечная палочка PolA. Средний 3′-5′-домен экзонуклеазы, отвечающий за корректуру, был радикально изменен и не работает.^[15] Он имеет функциональный 5′-3′-экзонуклеазный домен на амино-конце, описанный ниже. Остальные два домена действуют согласованно посредством движения связанных доменов.^[16]

Экзонуклеазный домен

Taq полимеразная экзонуклеаза является доменом на амино-конце Taq ДНК полимераза Я (термостабильный). Предполагается рибонуклеаза H-как мотив. Домен дает 5 ‘-3’ экзонуклеаза активность к полимеразе.^[17]

В отличие от того же домена в Кишечная палочка, которые разрушают праймеры и должны быть удалены путем расщепления для использования ПЦР,^[9] не говорят, что этот домен разрушает праймер.^[18] Это действие используется в TaqMan зонд: по мере образования дочерних цепей зонды, комплементарные матрице, входят в контакт с полимеразой и расщепляются на флуоресцентные части.^[19]

Связывание с ДНК

Taq полимераза связывается в своей щели в активном центре полимеразы с тупым концом дуплексной ДНК. Поскольку Taq полимераза находится в контакте со связанной ДНК, ее боковые цепи образуют водородные связи с пуринами и пиримидинами ДНК. Тот же регион Taq полимераза, связанная с ДНК, также связывается с экзонуклеазой. Эти структуры связаны с Taq полимеразы имеют разные взаимодействия.

Мутанты

А сайт-направленный мутагенез Сообщалось об эксперименте, который увеличивает активность исследуемой 3′-5 ‘экзонуклеазы в 2 раза, но никогда не сообщалось, снижает ли это количество ошибок.^[20] Следуя аналогичной линии мысли, химерные белки были получены путем сбора доменов вишни из Кишечная палочка, Taq, и T. neapolitana полимеразы I. Замена рудиментарного домена на функциональный из Кишечная палочка создали белок с возможностью корректуры, но с более низкой оптимальной температурой и низкой термостабильностью.^[21]

Были получены версии полимеразы без 5′-3′-экзонуклеазного домена, среди которых Клентак или Stoffel фрагмент наиболее известен. Полное отсутствие экзонуклеазной активности делает эти варианты подходящими для праймеров, которые проявляют вторичную структуру, а также для копирования кольцевых молекул.^[9] Другие варианты включают использование Клентак с высококачественной полимеразой, Термосеквеназа который распознает такие субстраты, как ДНК-полимераза Т7 делает, мутанты с более высокой толерантностью к ингибиторам или версии с «доменными тегами», которые имеют дополнительный спираль-шпилька-спираль вокруг каталитического сайта для более плотного удержания ДНК, несмотря на неблагоприятные условия.^[22]

Значение в обнаружении болезней

Из-за улучшений Taq полимераза, обеспечиваемая при репликации ДНК ПЦР: более высокая специфичность, меньшее количество неспецифических продуктов и более простые процессы и оборудование, она сыграла важную роль в усилиях по обнаружению заболеваний. «Использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) в диагностике инфекционных заболеваний привело к возможности ранней диагностики и надлежащего лечения заболеваний, вызванных привередливыми патогенами, определения чувствительности к противомикробным препаратам медленно растущих организмов и определения количества инфекции». ^[23] Реализация Taq полимераза спасла бесчисленное количество жизней. Он сыграл важную роль в выявлении многих самых страшных заболеваний в мире, включая туберкулез, стрептококковый фарингит, атипичную пневмонию, СПИД, корь, гепатит и язвенные урогенитальные инфекции. ПЦР, метод, используемый для воссоздания копий конкретных образцов ДНК, делает возможным обнаружение заболеваний за счет нацеливания на конкретную последовательность ДНК целевого патогена из образца пациента и увеличения следовых количеств индикативных последовательностей путем их копирования до миллиардов раз. Хотя это наиболее точный метод выявления заболеваний, особенно ВИЧ, он не выполняется так часто, как альтернативные, более низкие тесты из-за относительно высокой стоимости, трудозатрат и времени.^[24]

Опора на Taq Полимераза как катализатор процесса репликации ПЦР была подчеркнута во время пандемии COVID-19 в 2020 году. Нехватка необходимого фермента ограничила способность стран во всем мире производить тест-наборы для вируса. Без Taq полимеразы, процесс обнаружения болезни намного медленнее и утомителен.^[25]

Несмотря на преимущества использования Taq полимераза в обнаружении болезней ПЦР, фермент не лишен своих недостатков. Ретровирусные заболевания: ВИЧ, HTLV-1 и HTLV-II; часто включают в свой геном мутации от гуанина до аденина. Подобные мутации позволяют тестам ПЦР выявлять заболевания, но Taq Относительно низкая верность полимеразы приводит к возникновению такой же мутации G-to-A и, возможно, к ложноположительному результату теста.^[26]

Смотрите также

Рекомендации