Ошибка днк полимеразы последствия

Статья на конкурс «Био/Мол/Текст»: Феномен транслезионного синтеза ДНК (далее — ТЛС; от англ. translesion DNA synthesis — синтез ДНК через повреждение), к сожалению, мало где освещается. В учебниках по молекулярной биологии обычно об этом не пишут. Да и не сказать, что научных статей по этой тематике превеликое множество. Несмотря на вышеперечисленные факты, ТЛС является весьма значимым процессом, необходимым, в первую очередь, для поддержания целостности и стабильности генома клетки. В связи со сложившийся ситуацией автору хотелось бы пролить свет на данную, как ему кажется, неоднозначную, но столь важную тему. В этом обзоре я постарался изложить как фундаментальные аспекты данного процесса, так и затронуть прикладную сторону его изучения. А также попробовал ответить на вопрос (в какой-то степени философский), вынесенный в заголовок статьи.

Повреждение повреждению рознь

Казалось бы, генетический материал наших клеток, представленный в виде ДНК, должен быть суперстабильной структурой, чтобы обеспечивать как можно более точную передачу наследственной информации дочерним клеткам. Звучит максимально логично. Однако на деле есть пара нюансов. Сложно поверить, что клеточная ДНК только за день подвергается десяткам тысяч различных повреждений [1]! «Ну и что тут такого? — может возразить читатель. — У нас же есть системы репарации, они подлатают нашу ДНК!». В целом, конечно, он прав. Однако, к сожалению, не все так просто, как кажется на первый взгляд.

Конечно, системы репарации есть, и их несколько, и все они работают по различным механизмам [2]. Но и разнообразие повреждений, а также факторов, которые их вызывают, тяжело себе вообразить. В целом, повреждения ДНК могут являться результатом как внешних (экзогенных), так и внутренних (эндогенных) факторов.

К наиболее важным экзогенным факторам можно отнести ультрафиолетовое (УФ) излучение, ионизирующее излучение (ИИ) и различные (коих бесчисленное множество) химические агенты, модифицирующие ДНК. А такие процессы, протекающие внутри клеток практически каждого организма, как клеточное дыхание, перекисное окисление липидов, ошибочная репликация, спонтанное дезаминирование оснований, составляют группу эндогенных факторов [3].

NB! Важно разграничить понятия «повреждение ДНК» и «мутация». Под повреждением ДНК обычно подразумевают такое изменение первичной структуры ДНК, которое еще возможно вернуть к исходному состоянию. Мутация же представляет собой стойкое и необратимое изменение первичной структуры ДНК, которое будет передаваться дочерним клеткам. Таким образом, повреждение ДНК является потенциальной мутацией. В рамках данной статьи мы будем говорить преимущественно о мутациях, происходящих на генном уровне (не путать с геномными мутациями), а также затронем хромосомные перестройки.

Про виды повреждений, а также факторы, которые способствуют их появлению, можно было бы написать, как минимум, отдельный обзор, но мы ограничимся лишь их краткой характеристикой.

Начнем наш краткий разбор с наиболее «популярного» повреждения — апуриновый/апиримидиновый сайт (АП-сайт) (рис. 1А). Структура АП-сайта в буквальном смысле представляет собой голый сахарофосфатный «скелет», т.е. дезоксирибозу с фосфатной группой, лишенную азотистого основания. А лишиться его несложно — достаточно разорвать N-гликозидную связь между ним и сахаром. Большинство подобных повреждений возникают именно в результате самых обычных физиологических процессов, протекающих в клетке [3].

Окислительные повреждения также занимают одно из главных мест в структуре повреждений ДНК (рис. 1Б). Главные виновники — побочные продукты, образующиеся в ходе переноса электронов по дыхательной цепи, благодаря активности которой мы и многие другие организмы получаем энергию. Другими словами, такой физиологический процесс, как дыхание, является причиной образования активных форм кислорода (тех самых побочных продуктов), повреждающих ДНК. Окислению чаще всего подвергается гуанин с образованием 8-оксогуанина и его производных. Не менее опасными повреждениями являются тимидингликоль и различные окисленные «варианты» 5-метилцитозина [3].

Крайне мутагенные повреждения — фотопродукты, которые появляются, в первую очередь, из-за поглощения нуклеиновыми кислотами УФ излучения (рис. 1В). К таким относятся циклобутановые пиримидиновые димеры и (6–4) фотопродукты. Свойство УФ излучения — димеризация соседних тиминов — обусловлено его способностью образовывать ковалентную сшивку между ними [4].

Количество видов повреждений, вызванных действием алкилирующих агентов, тяжело поддается исчислению, поскольку модифицировать азотистые основания (а сайтов, по которым их можно алкилировать, тоже немало) потенциально может огромный спектр химических веществ, преимущественно экзогенного характера. Вышеперечисленные повреждения; повреждения, индуцированные химиотерапией при онкозаболеваниях; 1,N⁶-этеноаденин, дезаминированные основания, одно- и двухцепочечные разрывы ДНК… Список можно продолжать практически бесконечно. Повреждений очень много, и каждое, можно сказать, уникально в своем роде. Однако эволюция — штука хитрая, и почти на каждое повреждение найдется та или иная ферментативная система, которая поможет восстановить исходную структуру ДНК.

В зависимости от этиологии и типа повреждения, а также фазы клеточного цикла, задействуется тот или иной путь репарации. Стоит отметить, что большинство механизмов репарации являются высококонсервативными процессами, которые используются как у прокариот, так и эукариот. Конечно, различия между ними есть, но в целом механизмы очень похожи.

Клеточный цикл: а часики-то тикают

Неспроста отмечен тот факт, что активация той или иной системы репарации зависит от фазы клеточного цикла. Большинство репаративных систем активируются вне синтетической (S) фазы клеточного цикла — либо на ее ранних стадиях, что на самом деле вполне логично. Поскольку удвоение генетического материала клетки происходит в S фазу, то клетке попросту нужно успеть «отремонтировать» повреждения ДНК до момента его наступления, чтобы они не стали мутациями и не закрепились в геноме [5].

Однако по некоторым причинам повреждения ДНК могут ускользать от систем репарации, что гипотетически может приводить к неприятным последствиям (так, например, для эксцизионной репарации нуклеотидов в приоритете репарация (6–4) фотопродуктов, а вот некоторое количество циклобутановых пиримидиновых димеров «перекочует» в S фазу) [6]. Просто напомню, что человеческий геном все-таки немаленьких размеров, и порой даже нескольких репаративных систем недостаточно, чтобы устранить все последствия ДНК-повреждающих агентов.

Так что же делать, если клеточной ДНК не удалось успеть «залечить свои раны» перед репликацией? Отвечу, что не системами репарации едины, поскольку они являются лишь частью (хоть и значительной) более общего, более «объемного» метаболического пути под названием «ответ на повреждение ДНК» (DNA damage response, DDR) [7]. Помимо различных путей репарации, ответ на повреждение ДНК также может задействовать путь устойчивости к повреждениям ДНК (DDT, от англ. DNA damage tolerance). Конечно, на этапе S фазы, например, работает гомологичная рекомбинация, однако ее «субстратом» служат преимущественно двухцепочечные разрывы. Как быть с остальными типами повреждениями? Вот тут-то и приходит на помощь DDT, активирующий ТЛС. Чтобы понять, как он функционирует, нужно немного погрузиться в уже несколько раз упомянутый процесс репликации. Давайте попробуем более детально рассмотреть данный процесс.

«Столовые приборы» репликации

Мы не будем подробно останавливаться на том, как инициируется репликация, как осуществляется ее регуляция и на других тонкостях этого многогранного процесса. Тем не менее, позволю себе напомнить ключевые аспекты репликации ДНК. Кроме того, предлагаю заострить внимание на таких ключевых компонентах реплисомы, как ДНК-полимеразы. Еще в 1957 году ДНК-полимераза (которая, как позднее оказалось, далеко не одна) была впервые выделена из E. coli американским ученым Артуром Корнбергом, что положило начало изучению ферментов данного класса и репликации в целом [8]. А уже в следующем году блестящие опыты Мезельсона и Сталя позволили раскрыть основные принципы репликации, главный из которых — ее полуконсервативность [9]. Тем не менее, лишь спустя более чем 30 лет была предложена та модель репликации и репликативной вилки, которая известна нам на данный момент (хотя, стоит сказать, небольшие модификации она все же претерпела) [10]. Были совершены открытия и других репликативных ДНК-полимераз. Так, установлено, что в репликации ядерной ДНК эукариот задействовано три ДНК-полимеразы — Pol α, Pol δ и Pol ε. А для репликации митохондриальной ДНК животных предназначен отдельный фермент — Pol γ.

Конечно, ДНК-полимеразы — далеко не единственные участники репликации ДНК. Перед тем, как они «войдут в игру», саму репликацию нужно инициировать, что обычно происходит в специальных областях ДНК под названием точки ori. В таких сайтах в первую очередь происходит образование репликативных вилок. И чтобы их создать, требуется:

• (а) денатурировать участок (разорвать водородные связи между основаниями обеих цепей) в этой области;
• (б) загрузить в данный участок хеликазы, которые будут раскручивать ДНК по мере своего продвижения в противоположные стороны в направлении 5’→3’ (соблюдая, конечно же, принцип антипараллельности цепей), в результате чего образуются две репликативные вилки;
• (в) стабилизировать одноцепочечную ДНК за счет ее связывания со специальными белками и снять топологическое напряжение, которое возникает впереди вилки из-за раскручивания ДНК.

И только после вышеперечисленных событий на «подготовленную почву» приходят ДНК-полимеразы, а по итогу образуется целый белковый ансамбль — реплисома.

Теперь подбираемся к самому интересному. Представим, что наконец репликация инициировалась, громоздкая «машина» под названием реплисома собралась, и репликативная вилка от точки ori начинает свое путешествие. И вдруг прямо по курсу она замечает повреждение! То самое повреждение, которое каким-то чудом ускользнуло от систем репарации. Что же происходит при встрече с повреждением? Наиболее частый исход — застревание (stalling) репликативной вилки [11]. Иными словами, вилка просто останавливается на сайте повреждения и не имеет возможности продвинуться дальше. Такое состояние приводит к репликативному стрессу. На текущий момент науке известно несколько исходов такого явления. А ведь незаконченная репликация может грозить запуском апоптоза… Неужели клетка погибнет при таком раскладе? И вообще, почему вилка останавливается?

Вот где собака зарыта!

Причины, прежде всего, кроются в репликативной ДНК-полимеразе, а точнее — в ее строении. Вообще, чтобы описать строение практически любой ДНК-полимеразы, исследователи часто прибегают к ее сравнению с… правой рукой человека. Весьма необычная аналогия, как кажется автору (по правде говоря, сколько бы он ни смотрел на структуры ДНК-полимераз, лично ему очень тяжело разглядеть здесь руку). Любой фермент содержит область под названием активный центр, и полимеразы не исключение. И вне зависимости от вида ДНК-полимеразы, все они работают по примерно одному и тому же принципу [8].

Активный центр обеспечивает как связывание субстрата, так и его катализ. Каталитический кор ДНК-полимераз, ответственный, собственно, за полимеразную активность фермента, обычно представляет собой совокупность трех доменов, между которыми распределены различные функции. Непосредственно катализ реакции обеспечивает домен Palm (ладонь), в то время как другие домены — Fingers (пальцы) и Thumb (большой палец) осуществляют связывание субстрата (в данном случае субстрат у нас — входящий дезоксирибонуклеозидтрифосфат, дНТФ), удержание матричной и связывание растущей цепи ДНК. И примерно это выглядит так, что полураскрытая кисть правой руки как бы обхватывает вышеперечисленные «компоненты», необходимые для осуществления полимеразной реакции [15].

Но «обхват» у репликативных полимераз, стоит сказать, весьма специфический. Пространство, которое задается этими доменами, имеет ограниченную конфигурацию [16]. Такую, что фермент может лишь «запихнуть» в себя только комплементарные нуклеотиды (за редким исключением). А если все-таки происходит то самое редкое событие, то в их арсенале имеется еще один специальный домен, экзонуклеазный, распознающий и «откусывающий» неправильно вставленный нуклеотид. За этим механизмом самокоррекции (proofreading) стоит его 3’→5’ экзонуклеазная активность.

«Строгий» активный центр, обеспечивающий высокую селективность при включении дНТФ напротив матричного нуклеотида, 3’→5’-корректирующая активность, а также крайне высокая консервативность, обеспечивающая неизменность структуры в процессе эволюции, — «три кита», на которых держится высокоточная репликация генома практически любого организма. Однако, есть и другая сторона медали. Вместе с тем, эти же свойства, в первую очередь конформация активного сайта, не позволяют данным ферментам копировать поврежденные участки, вызывающие искажение двойной спирали ДНК. Они попросту не вписываются в ту геометрию, которая задается активным центром фермента. Кажется, настало время поговорить о тех самых загадочных «героях» нашей темы, «кузенах» репликативных полимераз — высокоспециализированных ферментах, транслезионных ДНК-полимеразах.

Виновники торжества

Итак, ДНК-полимеразы транслезионного синтеза, или просто транслезионные ДНК-полимеразы. На самом деле, их название весьма «говорящее», от англ. trans — через, lesion — повреждение. Что их делает такими уникальными? Да все тот же активный сайт [17]. Именно его особенности и позволяют транслезионной ДНК-полимеразе вставлять нуклеотид напротив повреждения. В процессе эволюции их активный сайт, как и структура в целом, претерпели некоторые изменения, благодаря чему ферменты и участвуют в ТЛС.

Таблица 1. Классификация эукариотических ДНК-полимераз

Семейство	Представители	Особенности
A	Pol γ Pol θ Pol 𝜈	Pol γ — репликация митохондриальной ДНК. Pol θ и Pol 𝜈 — участие в репарации двухцепочечных разрывов ДНК, ТЛС.
B	Pol ɑ Pol δ Pol ε Pol ζ	Высокоточные репликативные ДНК-полимеразы, копирующие ядерную ДНК. Pol ζ — транслезионная ДНК-полимераза.
X	Pol ꞵ Pol λ Pol ν TdT	Ферменты репарации, участвующие в эксцизионной репарации оснований и репарации двухцепочечных разрывов; имеют важную роль в обеспечении многообразия антител в организме; ТЛС.
Y	Pol η Pol ɩ Pol κ Rev1	Высокоспециализированные транслезионные ДНК-полимеразы.
AEP	PrimPol	Праймаза-полимераза, участвующая в ТЛС и механизмах, связанных с преодолением блока репликативной вилки.

Каноническими ДНК-полимеразами ТЛС считаются ферменты семейства Y, а также Pol ζ из семейства B, в которое, как вы могли заметить, входит большинство высокоточных репликативных ДНК-полимераз. Ферменты из семейства A (кроме Pol γ) и семейства X специализируются немного на других вещах, но также способны участвовать в ТЛС. По крайней мере, in vitro так уж точно. Кроме того, есть и другие семейства ДНК-полимераз. Например, семейство C, членами которого являются репликативные ДНК-полимеразы бактерий, а также семейство D, куда входят ферменты архей. Еще выделяют семейство RT, где «обитают» обратные транскриптазы. Однако мы сфокусируемся на эукариотических представителях семейств, представленных в таблице.

С классификацией вроде бы разобрались, теперь можно перейти к особенностям их активного центра, строение которого как раз-таки и заточено под прохождение полимеразой различных повреждений ДНК [18]. Поскольку вариантов повреждений очень много, то существует как минимум несколько ДНК-полимераз ТЛС, специализирующихся на их видах. Часто говорят, что их активный сайт обладает высокой «толерантностью» к повреждениям на матричной цепи ДНК.

Активный центр транслезионных ДНК-полимераз состоит из уже знакомых нам доменов Palm, Fingers и Thumb, выполняющих точно такие же функции, как и у репликативных «собратьев». Соответственно, общие черты «правой руки», ее архитектура, сохраняются. Тем не менее, существуют важные отличия. Так, количество контактов, которые образуют большой палец и пальцы транслезионных ДНК-полимераз с праймером и матричной цепью, соответственно, намного меньше, по сравнению с репликативными сородичами. За счет этого увеличивается «вместимость» активного сайта, что позволяет расположить в нем матричное повреждение [19]. Второе, не менее важное отличие, — наличие домена Little Finger (мизинец) у представителей семейства Y. Именно он и является тем самым важным фактором, определяющим узкую специализацию данных ферментов. Этот домен, который также называют polymerase-associated domain (PAD) важен тем, что образует дополнительные контакты с матрицей [20]. Таким образом, он помогает домену Fingers позиционировать матричный поврежденный нуклеотид в активном сайте фермента. Именно за счет этих свойств видоизмененный активный сайт и способен катализировать реакцию с поврежденными участками ДНК. Так или иначе, а как выглядит сам процесс ТЛС?

«Альтернативная» репликация

Ключевым событием, инициирующим непосредственно ТЛС, считается посттрансляционная модификация (а именно — убиквитинирование) белка PCNA (от англ. proliferating cell nuclear antigen, ядерный антиген пролиферирующих клеток) по лизину в положении 164, которое возникает в ответ на повреждение ДНК. PCNA, в первую очередь, представляет собой гомотример (т.е. состоит из трех идентичных между собой молекул). Вообще, это такой скользящий зажим, который, словно кольцо, обхватывает двухцепочечную спираль ДНК, благодаря которому репликативные полимеразы надежным образом связываются с матрицей (мы еще поговорим, почему это важно). Помимо этого, он является своеобразной «площадкой» для других молекул, работая в качестве молекулярного координатора [21]. На самом деле, его роль выходит далеко за пределы репликации и ТЛС, и об этом можно очень долго рассказывать, однако мы сфокусируемся на его функциях в ТЛС.

Само по себе убиквитинирование PCNA представляет собой очень сложно регулируемый механизм, зависящий от многих факторов: прохождения чекпоинтов клеточного цикла, и, соответственно, его стадии, типа повреждения ДНК, активации других путей, связанных с DTT, а также некоторых других факторов, требующих дальнейшего исследования. «Навешивание» убиквитина катализируется комплексом, состоящим из RAD18 и RAD6. Конечно, событиям привлечения RAD18/RAD6 и модификации PCNA предшествует целый каскад реакций, в котором участвует как минимум несколько белков, что уже немного выходит за рамки ТЛС [22].

Что же делает убиквитинированная форма PCNA? В первую очередь, она привлекает к застрявшей репликативной вилке наши таинственные ферменты. И на данном этапе их задача сводится к тому, чтобы поменяться местами с репликативными полимеразами. И вот тут возникают вопросы, как и при каких обстоятельствах это происходит. И меняются ли они вообще. В связи с этим было предложено несколько моделей, описывающих возможные сценарии, по которым дальше будет протекать ТЛС [22], [23].

Первая и, пожалуй, наиболее изученная называется моделью переключения полимераз (polymerase switching model). Нередко ее обозначают как двухполимеразную модель. Мы уже выяснили, что модифицированный PCNA вербует транслезионные полимеразы к репликативной вилке. Следующий шаг — смена полимераз. Считается, что первой в работу включается Rev1, которая сменяет репликативную полимеразу и связывается с PCNA. Rev1 снабжена множеством специальных регуляторных областей и сайтов связывания, опосредующих белок—белковые взаимодействия. Так, она служит неким «посредником», «хабом», если угодно, между PCNA и другими ДНК-полимеразами ТЛС, которые связываются уже с ней самой. Иными словами, «платформа» под названием Rev1, прежде всего, очень ценится за свои некаталитические функции. В конце концов, формируется комплекс, состоящий из регуляторных белков и нескольких транслезионных ДНК-полимераз — транслесома. И вот теперь модель начинает оправдывать оба своих названия.

Итак, задача первой полимеразы — вставить нуклеотид напротив повреждения. После того, как эта цель будет выполнена, происходит переключение на другую транслезионную полимеразу, которая удлиняет цепь уже после повреждения, вставляя некоторое количество (которое очень сильно варьирует) нуклеотидов напротив неповрежденных оснований матричной цепи. В соответствии с задачей, которую берет на себя та или иная ДНК-полимераза ТЛС, выделяют полимеразу-инсертер (первый этап, англ. insert — вставка, вставить) и полимеразу-экстендер (второй этап, англ. extend — удлинение, удлинять). По итогу все возвращается на круги своя, и репликативная ДНК-полимераза в составе реплисомы продолжает свое увлекательное путешествие, полное различных опасностей и препятствий.

Второй сценарий — смены между полимеразами не происходит. Точнее, она формально происходит, но если в первом случае репликативные полимеразы как бы «уступали» свои места, временно выходя из состава реплисомы, то в данной модели предполагается, что репликативные и высокоспециализированные полимеразы «сосуществуют» друг с другом внутри реплисомы. И как только они там все вместе уживаются? Выдвигается версия, что это все благодаря PCNA и его структуре, способной «приютить» все эти белки. Видимо, остальные этапы происходят аналогичным образом в соответствии с двухполимеразной моделью.

И, наконец, третья модель, построенная совершенно на иных принципах. Если вышеописанные модели сопряжены непосредственно с процессом репликации, происходящей в S фазу, то здесь развитие событий начинается непосредственно либо под самый ее конец, либо уже в фазу G2. Как только реплисома сталкивается с повреждением, она временно прекращает свою деятельность. Соответственно, напротив повреждения остается «дырка», а уже за ней, т.е. за областью повреждения, фермент PrimPol заново синтезирует праймер (помните, что это не только полимераза, но и праймаза? А в качестве «строительных кирпичиков» она использует не рибонуклеотиды, а дезоксинуклеотиды!), который репликативные полимеразы будут достраивать в составе возобновившей свою работу реплисомы. Такое явление получило название репрайминг [24]. А по окончании работы реплисомы (или когда она будет находиться далеко-далеко от сайта с повреждением) в эту область привлекаются транслезионные полимеразы, которые, образно говоря, «латают брешь» (отсюда и еt название — gap-filling model; русскоязычного аналога не встречал, можно перевести как «заполнение брешей»). Получается эдакая версия пострепликативной репарации. Тем не менее, и такой сюжет имеет место быть.

Конечно, остается очень много пробелов. Как происходит процесс in vivo? На обоих ли цепях могут функционировать ДНК-полимеразы ТЛС? Какая все-таки модель наиболее точно описывает данный процесс? И еще очень-очень много других, не менее важных вопросов, на которые хотелось бы получить ответы.

Выжить, но какой ценой?

Думаю, дорогой читатель задается вопросом: есть ли вообще какая-нибудь практическая значимость изучения данных ферментов? Допустим, ученые идентифицировали эти белки, проанализировали их структурные и биохимические свойства, а что дальше? Как это может помочь, например, в лечении болезней?

Изучением ТЛС и ассоциированных с ним молекул занимаются «представители» фундаментальной науки. Тем не менее, вопросы фундаментальной науки с течением времени могут плавно перетекать уже в задачи прикладной. Поэтому ответ — да, анализ ТЛС является важной задачей (на самом деле, такое утверждение будет справедливым для практически любой молекулы / метаболического пути / явления в целом)! С уверенностью могу сказать, что уже существуют определенные успехи в решении некоторых задач, поставленных перед исследователями. Однако, чтобы более подробно и точно ответить на вопрос, как все-таки изучение такого фундаментального процесса, как ТЛС, способно помочь нам, мы вернемся к транслезионным ДНК-полимеразам.

Как мы уже поняли, ТЛС — вовсе не альтернатива репаративным системам, а скорее крайне важное приложение к ним. Это совершенно иной метаболический путь, помогающий репликативной вилке преодолевать области ДНК с повреждениями. Однако порой бывает так, что активация ТЛС потом может дорого обойтись. Так какая же именно цена должна быть уплачена, чтобы клетка могла продолжить репликацию и выжить?

За измененный активный сайт, способный вмещать в себя различные повреждения, транслезионные ДНК-полимеразы «поплатились», прежде всего, двумя вещами [17–19]. И первая из них — точность. Под этим термином имеется в виду отношение частоты включения правильного нуклеотида к частоте вставки неправильного. Вторая — процессивность — означает такое количество нуклеотидов, которое полимераза способна добавить к растущей цепи праймера всякий раз, когда связывается с матричной цепью. Можно сказать, что этот показатель характеризует свойство сохранять сродство фермента с матрицей на протяжении всей репликации.

Репликативные ДНК-полимеразы обладают высокими значениями как точности, так и процессивности. Про особенности репликативных ДНК-полимераз, обеспечивающих их высокую точность, мы уже поговорили ранее. Что касается другого свойства, то за один раунд связывания с матрицей они способны добавить аж несколько сотен тысяч нуклеотидов! Такие высокие значения достигаются за счет следующих факторов:

• некаталитических субъединиц, обеспечивающих прочное связывание фермента с матрицей;
• клэмпа, плотно обхватывающего молекулы ДНК, словно зажим;
• уникальных доменов, осуществляющих дополнительное «сцепление» с матричной цепью (напр., домен P у дрожжевой Pol ε);
• дополнительных белков (RPA, RFC и др.).

Транслезионные полимеразы будут характеризоваться исключительно низкими показателями как точности, так и процессивности. Исключение составляет разве что Pol ζ, обладающая повышенной процессивностью по сравнению с ферментами семейства Y (но, так или иначе, в этом отношении ей все равно далеко до «родных братьев») [25]. Такое свойство делает из нее отличного кандидата на роль полимеразы-экстендера. Полимеразы ТЛС с низкой процессивностью, в свою очередь, хорошо подходят на роль инсертеров. Вот вроде бы и нашли «актеров» для театра под названием ТЛС. А что они попросят за свое участие?

Просить, конечно же, ничего не будут, однако от их «игры» есть крайне неприятные «побочные эффекты». Вместо того, чтобы препятствовать мутациям и поддерживать стабильность генома, они с немалой долей вероятности сами же могут им способствовать, нарушая и без того хрупкое геномное «равновесие». Причина, как вы, наверное, уже догадались, кроется в их крайне низкой точности. Таким образом, «герои» данной статьи превращаются в антигероев. Ферменты, призванные бороться с неприятностями, нередко сами их и создают. С другой стороны, а что будет бóльшим злом для клетки? Парочка мутаций на генном уровне (которые чаще всего представляют собой однонуклеотидные замены) или крупные хромосомные перестройки (а может даже и гибель клетки в результате незавершения репликации)? Очевидно, что последнее. Вообще, было бы неплохо иметь опцию «из двух зол не выбирать вовсе», но имеем то, что имеем.

За гранью ТЛС

На самом деле, функции транслезионных выходят сильно за пределы ТЛС. Они активно принимают участие в жизни клетки, занимая важные места в самых различных процессах, связанных с ДНК. И даже иногда такие их слабые стороны, как крайне низкая точность, способствующая более интенсивному накоплению мутаций, клетка способна использовать себе во благо.

Так, например, установлено, что практически все члены семейства Y ДНК-полимераз играют важную роль в процессе соматического гипермутагенеза генов иммуноглобулинов, лежащего в основе обеспечения разнообразия антител в организме. Вот здесь-то и пригодились их «умения», поскольку от них только и требуется, что «наделать» мутаций в вариабельных областях тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов в B-клетках иммунной системы [27–31].

Но список этим не ограничивается. Кроме того, многие из них принимают участие в копировании таких сложно реплицируемых областей (для репликативных полимераз), как ломкие сайты хромосом [32], [33]. Тут им приходится быть максимально осторожными, поскольку в этих областях, богатых на повторы, очень часто локализуются онкогены и онкосупрессорные гены.

Транслезионные полимеразы призваны помогать и на других последовательностях, таких как микросателлиты (которые, кстати, также характеризуются наличием повторов) [34–36]. Стоит отметить, что нестабильность этих областей может послужить причиной образования целого ряда неканонических форм ДНК: Z-ДНК, H-ДНК, G-квадруплексы и другие [37]. В репликации последних, кстати, ДНК-полимеразы ТЛС участвуют почти всем семейством Y [38–41].

Вышеперечисленные процессы требуют преимущественно лишь ДНК-полимеразную активность. Наличие дополнительных активностей (например, 5’-дезоксирибофосфатлиазной) и структурных особенностей предположительно позволяет участвовать им в таких репаративных процессах, как BER, c-NHEJ и alt-EJ [42–44]. Так или иначе, многие нерепликативные ДНК-полимеразы имеют в своем арсенале удивительные «способности», значительно расширяющие наше представление о них. Как видите, не такими уж и узкими специалистами, ограниченными лишь ТЛС, они оказались.

Дефекты «дефектных» полимераз

Последствия мутаций и полиморфизмов в генах, кодирующих нерепликативные ДНК-полимеразы, в большинстве случаев нелетальны для млекопитающих. Так или иначе, здесь прослеживается зависимость от того, в каком именно гене появится нарушение и какую структурную область ДНК-полимеразы ТЛС оно затронет. Наиболее показательный пример — мутации гена POLN (кодирующего, соответственно, Pol η), приводящие к потере активности фермента. Поскольку основная функция данной полимеразы — прохождение фотопродуктов, возникающих в результате пагубного воздействия УФ на геном клеток кожи, защита организма от такого вида излучения резко падает [45–47]. Такое предраковое состояние называется пигментной ксеродермой [48].

Еще одна интересная взаимосвязь была недавно найдена между нарушениями в гене REV3L (кодирует каталитическую субъединицу Rev3L ДНК-полимеразы Pol ζ) и развитием синдрома Мёбиуса и болезни, характеризующейся задержкой развития с гипотрофией и рядом других проявлений [49], [50].

В теории, помимо рака и вышеперечисленных заболеваний, мутации транслезионных полимераз могут приводить к развитию некоторых нейродегенеративных заболеваний, в патогенезе которых одно из ключевых положений занимает явление под названием «экспансия тринуклеотидных повторов».

Почему так важно соблюдать баланс

Да, с одной стороны, плата за использование ТЛС высока, с другой — клетка выживает. Вроде бы можно и порадоваться за нее. Но точно не в случае ее трансформации в злокачественную в результате накопления критических мутаций в т.н. драйверных генах. Конечно, далеко не обязательно, что транслезионная ДНК-полимераза вставит некорректный нуклеотид напротив матричного, копируя часть именно такого гена. Тем не менее, от этого никто не застрахован, особенно в условиях изменения их активности и экспрессии.

Различные нарушения в регуляции экспрессии транслезионных ДНК-полимераз могут сильно осложнить нам жизнь. И заодно облегчить жизнь опухолевым клеткам. Когда клетка утрачивает контроль над экспрессией и активностью данных ферментов, это выливается в печальные последствия для организма. Ведь если они отвечают за прохождение повреждений в наших клетках (и некоторые другие функции, которые мы разобрали выше), то логично предположить, что как минимум то же самое они делают и в раковых. Рассмотрим несколько ситуаций:

1. Недостаточная экспрессия в нормальных клетках. Вроде бы все понятно. Путь ТЛС будет меньше задействоваться, соответственно, клетка становится более чувствительной к ДНК-повреждающим агентам. В лучшем случае, в процессе репликации при столкновении с повреждением клетка отделается «легким испугом» в виде однонуклеотидной замены (другие ДНК-полимеразы ТЛС могут «подменить» слабо экспрессирующийся фермент, однако их специализация на других повреждениях не добавляет им точности), в худшем — получит крупные хромосомные перестройки или вовсе апоптирует.
2. Чрезмерная экспрессия/активность в нормальных клетках. Логично, что это будет только способствовать мутагенезу в результате более частого использования транслезионных полимераз (которые, кстати, могут задействоваться, как мы выяснили ранее, и в процессе репликации неповрежденных участков ДНК), а значит, для нормальной клетки такую ситуацию точно не назвать хорошей.
3. Чрезмерная экспрессия/активность в раковых клетках. В большинстве случаев это является благоприятной ситуацией для них. «Постойте, но почему это хорошо для опухолевой клетки? — поинтересуется читатель. — Ведь вы же сами написали, что использование данного пути сопряжено с возникновением мутаций». Именно! В таком случае раковая клетка убивает двух зайцев одним выстрелом: с одной стороны, это ведет к еще большей частоте возникновения мутаций (а такая изменчивость, как правило, ей только на руку), а с другой — обеспечивается резистентность, прежде всего, к таким широко использующимся химиотерапевтическим лекарствам, как препараты платинового ряда (цисплатин, оксалиплатин и др.). Пожалуй, вот и место, где можно «размахнуться» исследователям.
4. Недостаточная экспрессия/активность в раковых клетках. На самом деле, данная ситуация весьма неоднозначна, поскольку далеко не всегда прослеживается взаимосвязь между этим явлением и изменением частоты мутагенеза и резистентности к химиопрепаратам именно в таких клетках. Нередко это зависит от того, какая именно ДНК-полимераза недостаточно экспрессируется.

Добиваемся гармонии

Очевидно, что если подавить гиперэкспрессию ДНК-полимераз ТЛС в раковых клетках, то можно добиться снижения их устойчивости к химиотерапевтическим препаратам. Вполне неплохая поддержка для базисной терапии, не так ли? Очень часто на роль таких ингибиторов рассматривают класс малых РНК, а точнее их подтип — микроРНК (miRNA), представляющие собой короткие некодирующие одноцепочечные РНК длиной 18–25 п.н. . Связываясь с последовательностью в 3’-нетранслируемой области целевой мРНК, она блокирует дальнейшую трансляцию продукта, в нашем случае — определенной ДНК-полимеразы [51].

Об огромном разнообразии РНК вы можете прочитать в работе «Обо всех РНК на свете, больших и малых» [52].

Конечно, это не единственный способ повлиять на экспрессию/активность «виновников» данной статьи. В качестве иной стратегии можно попробовать связать уже готовый продукт, т.е. сам фермент, тем самым нарушить его взаимодействие с транслесомой. В результате скрининга, методов in silico и экспериментов на клеточных культурах было выявлено несколько потенциальных низкомолекулярных соединений [53]. Еще одним перспективным направлением является синтез РНК- и ДНК-аптамеров , избирательно связывающих белки (и не только) [54].

Подробнее об аптамерах смотрите в комиксе «Аптамеры: графический гайд» [55].

На текущий момент соединения, влияющие на данные свойства полимераз, изучаются преимущественно in vitro, иными словами, проходят доклинические испытания . Тем не менее, по данным на конец 2020 года, первые клинические испытания для ингибиторов Pol θ уже должны были стартовать в 2021 году [56]. Более того, различные свойства ДНК-полимераз (например, уровень их экспрессии, наличие полиморфизмов) и вовсе могут иметь некоторую прогностическую ценность, важную для лечащих врачей [57], [58].

Подробнее о том, как разрабатываются терапевтические препараты, вы можете узнать из цикла статей, включенных в спецпроект «Доклиника».

Надеюсь, у меня получилось объяснить, почему изучение фундаментальных процессов и механизмов, согласно которым они протекают, является важным моментом. Конечно, на данном этапе пока очень рано говорить о клиническом применении вышеперечисленных соединений, поскольку эффективность многих из них была показана лишь in vitro. Более того, мы все прекрасно понимаем, что помимо ДНК-полимераз, участвующих в ТЛС, есть огромное количество других белков, нарушение регуляции которых может повлечь за собой еще более печальные последствия. Тем не менее, поиск, идентификация, разработка и модификация таргетных терапевтических средств, влияющих на активность и экспрессию ДНК-полимераз ТЛС представляет собой, может быть, и не самую важную цель на данный момент, но является весьма перспективным направлением, развитие которого способно спасти не одну жизнь.

Открытый финал

Так кто же все-таки транслезионные полимеразы? Те самые герои из комиксов, пожертвовавшие почти всем ради поддержания стабильности общества генома клетки? Или же коварные притаившиеся враги, только и ждущие, как бы нарушить ее? Конечно, так однобоко судить их мы не можем в силу различных обстоятельств. Впрочем, как и сам этот мир, так и эту жизнь, где нет четкого разделения на черное и белое, но где все имеет свою цену. Клетка, всякий раз активирующая путь транслезионного синтеза, нередко ценой мутаций (скольких?) получает возможность выжить. Равноценный ли это обмен? Лично я затрудняюсь ответить на данный вопрос. Наверное, для самой клетки это выгодная «сделка» здесь и сейчас. Для организма же в целом — однозначно сказать нельзя, покажет только время.

1. А. V. Ignatov, K. A. Bondarenko, A. V. Makarova. (2017). Non-bulky Lesions in Human DNA: The Ways of Formation, Repair, and Replication. Acta Naturae. 9, 12-26;
2. Биологическая машина репарации ДНК;
3. Nimrat Chatterjee, Graham C. Walker. (2017). Mechanisms of DNA damage, repair, and mutagenesis. Environ. Mol. Mutagen.. 58, 235-263;
4. Jean Cadet, Thierry Douki. (2018). Formation of UV-induced DNA damage contributing to skin cancer development. Photochem. Photobiol. Sci.. 17, 1816-1841;
5. Nicole Hustedt, Daniel Durocher. (2017). The control of DNA repair by the cell cycle. Nat Cell Biol. 19, 1-9;
6. D.L. Mitchell, C.A. Haipek, J.M. Clarkson. (1985). (6–4)Photoproducts are removed from the DNA of UV-irradiated mammalian cells more efficiently than cyclobutane pyrimidine dimers. Mutation Research Letters. 143, 109-112;
7. Ghosal G., Chen J. (2013). DNA damage tolerance: a double-edged sword guarding the genome. Transl Cancer Res. 2, 107–129;
8. 12 методов в картинках: генная инженерия. Часть II: инструменты и техники;
9. M. Meselson, F. W. Stahl. (1958). The replication of DNA in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences. 44, 671-682;
10. Youri I. Pavlov, Anna S. Zhuk, Elena I. Stepchenkova. (2020). DNA Polymerases at the Eukaryotic Replication Fork Thirty Years after: Connection to Cancer. Cancers. 12, 3489;
11. Jessica L. Alexander, Terry L. Orr-Weaver. (2016). Replication fork instability and the consequences of fork collisions from rereplication. Genes Dev.. 30, 2241-2252;
12. Ralph Scully, Rajula Elango, Arvind Panday, Nicholas A Willis. (2021). Recombination and restart at blocked replication forks. Current Opinion in Genetics & Development. 71, 154-162;
13. Kenneth J. Marians. (2018). Lesion Bypass and the Reactivation of Stalled Replication Forks. Annu. Rev. Biochem.. 87, 217-238;
14. Апоптоз, или Путь самурая;
15. William A Beard, Samuel H Wilson. (2003). Structural Insights into the Origins of DNA Polymerase Fidelity. Structure. 11, 489-496;
16. Wei Yang, Yang Gao. (2018). Translesion and Repair DNA Polymerases: Diverse Structure and Mechanism. Annu. Rev. Biochem.. 87, 239-261;
17. Alexandra Vaisman, Roger Woodgate. (2017). Translesion DNA polymerases in eukaryotes: what makes them tick?. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 52, 274-303;
18. M. F. Goodman, R. Woodgate. (2013). Translesion DNA Polymerases. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a010363-a010363;
19. Julian E. Sale, Alan R. Lehmann, Roger Woodgate. (2012). Y-family DNA polymerases and their role in tolerance of cellular DNA damage. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 141-152;
20. A. V. Makarova, A. V. Kulbachinskiy. (2012). Structure of human DNA polymerase iota and the mechanism of DNA synthesis. Biochemistry Moscow. 77, 547-561;
21. E.M. Boehm, M.S. Gildenberg, M.T. Washington. (2016). The Many Roles of PCNA in Eukaryotic DNA Replication. DNA Replication Across Taxa. 231-254;
22. Domenico Maiorano, Jana El Etri, Camille Franchet, Jean-Sébastien Hoffmann. (2021). Translesion Synthesis or Repair by Specialized DNA Polymerases Limits Excessive Genomic Instability upon Replication Stress. IJMS. 22, 3924;
23. Xiaolu Ma, Tie‐Shan Tang, Caixia Guo. (2020). Regulation of translesion DNA synthesis in mammalian cells. Environ Mol Mutagen. 61, 680-692;
24. Elizaveta Boldinova, Paulina Wanrooij, Evgeniy Shilkin, Sjoerd Wanrooij, Alena Makarova. (2017). DNA Damage Tolerance by Eukaryotic DNA Polymerase and Primase PrimPol. IJMS. 18, 1584;
25. Alena V. Makarova, Peter M. Burgers. (2015). Eukaryotic DNA polymerase ζ. DNA Repair. 29, 47-55;
26. Agnès Tissier, John P. McDonald, Ekaterina G. Frank, Roger Woodgate. (2000). polι, a remarkably error-prone human DNA polymerase. Genes Dev.. 14, 1642-1650;
27. Andrew Franklin, Peter J Milburn, Robert V Blanden, Edward J Steele. (2004). Human DNA polymerase‐η, an A‐T mutator in somatic hypermutation of rearranged immunoglobulin genes, is a reverse transcriptase. Immunol Cell Biol. 82, 219-225;
28. Leticia K. Lerner, Thuy V. Nguyen, Ligia P. Castro, Juliana B. Vilar, Veridiana Munford, et. al.. (2020). Large deletions in immunoglobulin genes are associated with a sustained absence of DNA Polymerase η. Sci Rep. 10;
29. Ahmad Faili, Anne Stary, Frédéric Delbos, Sandra Weller, Said Aoufouchi, et. al.. (2009). A Backup Role of DNA Polymerase κ in Ig Gene Hypermutation Only Takes Place in the Complete Absence of DNA Polymerase η. J Immunol. 182, 6353-6359;
30. Anna-Laura Ross, Julian E. Sale. (2006). The catalytic activity of REV1 is employed during immunoglobulin gene diversification in DT40. Molecular Immunology. 43, 1587-1594;
31. Jacob G. Jansen, Petra Langerak, Anastasia Tsaalbi-Shtylik, Paul van den Berk, Heinz Jacobs, Niels de Wind. (2006). Strand-biased defect in C/G transversions in hypermutating immunoglobulin genes in Rev1-deficient mice. Journal of Experimental Medicine. 203, 319-323;
32. Ryan P. Barnes, Suzanne E. Hile, Marietta Y. Lee, Kristin A. Eckert. (2017). DNA polymerases eta and kappa exchange with the polymerase delta holoenzyme to complete common fragile site synthesis. DNA Repair. 57, 1-11;
33. Valérie Bergoglio, Anne-Sophie Boyer, Erin Walsh, Valeria Naim, Gaëlle Legube, et. al.. (2013). DNA synthesis by Pol η promotes fragile site stability by preventing under-replicated DNA in mitosis. Journal of Cell Biology. 201, 395-408;
34. Suzanne E. Hile, Xiaoxiao Wang, Marietta Y. W. T. Lee, Kristin A. Eckert. (2012). Beyond translesion synthesis: polymerase κ fidelity as a potential determinant of microsatellite stability. Nucleic Acids Research. 40, 1636-1647;
35. Suzanne E. Hile, Kristin A. Eckert. (2008). DNA polymerase kappa produces interrupted mutations and displays polar pausing within mononucleotide microsatellite sequences. Nucleic Acids Research. 36, 688-696;
36. M Dixon. (2002). Examining the potential role of DNA polymerases η and ζ in triplet repeat instability in yeast. DNA Repair. 1, 763-770;
37. Левозакрученная: загадочная Z-ДНК;
38. Sarah Eddy, Magdalena Tillman, Leena Maddukuri, Amit Ketkar, Maroof K. Zafar, Robert L. Eoff. (2016). Human Translesion Polymerase κ Exhibits Enhanced Activity and Reduced Fidelity Two Nucleotides from G-Quadruplex DNA. Biochemistry. 55, 5218-5229;
39. Davide Schiavone, Guillaume Guilbaud, Pierre Murat, Charikleia Papadopoulou, Peter Sarkies, et. al.. (2014). Determinants of G quadruplex‐induced epigenetic instability in
    REV
    1‐deficient cells. EMBO J. 33, 2507-2520;

40. Sarah Eddy, Amit Ketkar, Maroof K. Zafar, Leena Maddukuri, Jeong-Yun Choi, Robert L. Eoff. (2014). Human Rev1 polymerase disrupts G-quadruplex DNA. Nucleic Acids Research. 42, 3272-3285;
41. Rujuta Yashodhan Gadgil, Eric J. Romer, Caitlin C. Goodman, S.Dean Rider, French J. Damewood, et. al.. (2020). Replication stress at microsatellites causes DNA double-strand breaks and break-induced replication. Journal of Biological Chemistry. 295, 15378-15397;
42. Katarzyna Bebenek, Agnès Tissier, Ekaterina G. Frank, John P. McDonald, Rajendra Prasad, et. al.. (2001). 5′-Deoxyribose Phosphate Lyase Activity of Human DNA Polymerase ɩ in Vitro. Science. 291, 2156-2159;
43. Dheva Setiaputra, Daniel Durocher. (2019). Shieldin – the protector of
    DNA
    ends. EMBO Rep. 20;

44. Alessandra Brambati, Raymond Mario Barry, Agnel Sfeir. (2020). DNA polymerase theta (Polθ) – an error-prone polymerase necessary for genome stability. Current Opinion in Genetics & Development. 60, 119-126;
45. C. Masutani. (2000). Mechanisms of accurate translesion synthesis by human DNA polymerase eta. The EMBO Journal. 19, 3100-3109;
46. A HENDEL, O ZIV, Q GUERANGER, N GEACINTOV, Z LIVNEH. (2008). Reduced efficiency and increased mutagenicity of translesion DNA synthesis across a TT cyclobutane pyrimidine dimer, but not a TT 6-4 photoproduct, in human cells lacking DNA polymerase η. DNA Repair. 7, 1636-1646;
47. Robert E. Johnson, Lajos Haracska, Satya Prakash, Louise Prakash. (2001). Role of DNA Polymerase η in the Bypass of a (6-4) TT Photoproduct. Mol Cell Biol. 21, 3558-3563;
48. Alexei Gratchev, Pamela Strein, Jochen Utikal, Sergij Goerdt. (2003). Molecular genetics of Xeroderma pigmentosum variant. Experimental Dermatology. 12, 529-536;
49. Laura Tomas-Roca, Anastasia Tsaalbi-Shtylik, Jacob G. Jansen, Manvendra K. Singh, Jonathan A. Epstein, et. al.. (2015). De novo mutations in PLXND1 and REV3L cause Möbius syndrome. Nat Commun. 6;
50. Agnieszka Halas, Jolanta Fijak-Moskal, Renata Kuberska, Victor Murcia Pienkowski, Aneta Kaniak-Golik, et. al.. (2021). Developmental delay with hypotrophy associated with homozygous functionally relevant REV3L variant. J Mol Med. 99, 415-423;
51. Priyanka Saha, Tanima Mandal, Anupam D. Talukdar, Deepak Kumar, Sanjay Kumar, et. al.. (2021). DNA polymerase eta: A potential pharmacological target for cancer therapy. J Cell Physiol. 236, 4106-4120;
52. Обо всех РНК на свете, больших и малых;
53. Anna Schrempf, Jana Slyskova, Joanna I. Loizou. (2021). Targeting the DNA Repair Enzyme Polymerase θ in Cancer Therapy. Trends in Cancer. 7, 98-111;
54. Andrei V. Lakhin, Andrei A. Kazakov, Alena V. Makarova, Yuri I. Pavlov, Anna S. Efremova, et. al.. (2012). Isolation and Characterization of High Affinity Aptamers Against DNA Polymerase Iota. Nucleic Acid Therapeutics. 22, 49-57;
55. Аптамеры: графический гайд;
56. Anna Schrempf, Jana Slyskova, Joanna I. Loizou. (2021). Targeting the DNA Repair Enzyme Polymerase θ in Cancer Therapy. Trends in Cancer. 7, 98-111;
57. Srdana Grgurevic, Patricia Montilla-Perez, Alice Bradbury, Julia Gilhodes, Sophie Queille, et. al.. (2018). DNA polymerase ν gene expression influences fludarabine resistance in chronic lymphocytic leukemia independently of p53 status. Haematologica. 103, 1038-1046;
58. Roberta Taiane G. de Oliveira, Ivo Gabriel. F. França, Howard L.R. Junior, Giovanna B.C. Riello, Daniela de Paula Borges, et. al.. (2021). c.9253-6T > c REV3L: A novel marker of poor prognosis in Myelodysplastic syndrome. Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 43, 377-381.

ДНК-полимеразы отвечают за синтез ДНК — вещества наследственности. Именно в ДНК хранятся «инструкции», управляющие биохимическими реакциями в клетке: в нуклеотидной последовательности закодирована информация о структуре транспортных и рибосомальных РНК и всех белков.

При делении клеток ДНК-полимеразы удваивают ДНК в ходе репликации. Двухцепочечная ДНК расплетается, и задача ДНК-полимеразы — выбрать и включить правильный (комплементарный) нуклеотид, не совершив ошибки, которая приведет к мутации. Для синтеза всем ДНК-полимеразам обязательно нужен праймер, который синтезирует праймаза. Точность репликации очень высока: в среднем одна ошибка случается на миллиард нуклеотидов. У человека известно 16 ДНК-полимераз, но в репликации геномной ДНК задействованы всего три: Pol delta, Pol epsilon и Pol alpha в комплексе с праймазой.

Для чего нужны остальные ДНК-полимеразы

Большинство ДНК-полимераз защищают клетки от повреждений ДНК. Каждый день в клетке образуются десятки тысяч повреждений. Они могут быть вызваны окислительным стрессом, радиацией, ультрафиолетовым излучением или химическими канцерогенами окружающей среды. Многие повреждения ДНК блокируют высокоточные репликативные ДНК-полимеразы — остановка репликации может вызвать хромосомные нарушения и гибель клетки.

Существует несколько уровней защиты от повреждений ДНК. Основным механизмом защиты является репарация. Большинство поврежденных оснований и нуклеотидов удаляются из ДНК, а бреши точно застраиваются специализированными ДНК-полимеразами. Если повреждения избежали репарации, запускается альтернативный механизм защиты — синтез через повреждения, или транслезионный синтез. Транслезионные ДНК-полимеразы нетребовательны к структуре ДНК и эффективно включают нуклеотиды напротив поврежденных участков.

Существуют и другие механизмы защиты. Испанские исследователи в 2013 году описали фермент PrimPol, который одновременно обладает ДНК-полимеразной и ДНК-праймазной активностями. PrimPol может запустить остановленную репликацию, начав синтез ДНК после поврежденного участка по новой (синтез ДНК-праймера).

Транслезионный синтез ДНК и канцерогенез

В отличие от репликативных ДНК-полимераз точность синтеза транслезионных и PrimPol невелика: они совершают ошибки каждые 100–1000 нуклеотидов. Защищая клетки от повреждений ДНК, эти ДНК-полимеразы становятся источником мутаций. Конечно, такой мутагенез может быть опасен. Слишком высокая активность транслезионных ДНК-полимераз повышает риск возникновения онкологических заболеваний.

Но и потеря функций транслезионных ДНК-полимераз связана с канцерогенезом. Например, Pol eta синтезирует ДНК на участках с повреждениями, вызванными ультрафиолетом. Мутации Pol eta вызывают наследуемый синдром варианта пигментной ксеродермы. У пациентов к 20–40 годам часто развиваются множественные опухоли кожи. Потому очень важна правильная «настройка» процесса транслезионного синтеза.

Транслезионные ДНК-полимеразы и иммунитет

Мутагенез не всегда вреден и может быть даже полезен. Некоторые транслезионные ДНК-полимеразы вносят мутации в гены иммуноглобулинов в B-лимфоцитах. Это позволяет увеличить разнообразие антител и важно для формирования иммунного ответа на инфекции.

Транслезионные ДНК-полимеразы — мишени для противоопухолевой терапии

Действие многих препаратов химиотерапии основано на блокировании деления опухолевых клеток. К ним относятся алкилирующие соединения, препараты платиновой группы и нуклеотидные аналоги. Транслезионные ДНК-полимеразы помогают опухолевым клеткам преодолеть блоки репликации, вызванные этими препаратами. В нескольких лабораториях в мире уже получены ингибиторы ДНК-полимераз на основе низкомолекулярных химических соединений и рибозимов.

***

В нашей лаборатории мы пытаемся понять биологическую роль отдельных ДНК-полимераз. Для этого мы получаем рекомбинантные очищенные ДНК-полимеразы человека, синтезируя и выделяя их из клеток микроорганизмов. Затем мы изучаем их свойства с помощью реакций синтеза ДНК in vitro. Мы можем узнать, какие повреждения они «проходят», как часто совершают ошибки. Недавно совместно с лабораторией белковой инженерии профессора Дмитрия Жаркова из Новосибирска мы инициировали исследования на культурах клеток человека. С помощью методики рCRISPR-Cas9 мы выключили гены нескольких ДНК-полимераз, чтобы понять их вклад в клеточный ответ на окислительный стресс, химические канцерогены и препараты химиотерапии.

В любой популяции всегда встречаются разные варианты одного и того же гена. Полиморфизмы ДНК-полимераз могут влиять на индивидуальные риски развития заболеваний. Недавно мы обнаружили, что редкий полиморфизм очень сильно снижает активность Pol iota. Поскольку Pol iota защищает от рака легких, вызванного канцерогенными веществами, в дальнейшем было бы интересно узнать, насколько часто этот вариант встречается у курящих пациентов.

Наконец, недавно мы получили ДНК-аптамеры к Pol eta и PrimPol, эффективно связывающие эти ферменты и ингибирующие их активность. ДНК-аптамеры могут быть использованы вместо антител для анализа уровня экспрессии ДНК-полимераз в биологических образцах и потенциально в качестве ингибиторов.

Понимание механизмов транслезионного синтеза ДНК позволит лучше понять механизмы канцерогенеза и химиорезистентности и, возможно, продвинуться на один шаг вперед в лечении онкологических заболеваний.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 616.006.04-092:612.014.1]:577.21.08

А.В. Лахин1, А.С. Ефремова1, И.В. Макарова1, Е.Е. Гришина2, С.И. Шрам1, В.З. Тарантул1,

Л.В. Генинг1

влияние mn (ii) на ошибочную активность днк-полимеразы йота в экстрактах нормальных и опухолевых клеток человека

1Институт молекулярной генетики РАН, Москва; 2Офтальмологическая клиническая больница Департамента

здравоохранения Москвы

ДНК-полимераза йота (Pol i), обладающая рядом необычных свойств и крайне неточным синтезом ДНК, относится к группе ферментов, каталитическая активность которых преимущественно активируется Mn2+, а не Mg2+. В этой работе с помощью метода misGvA (misincorporation of «G» versus «A», method of Gening) изучено влияние концентрации Mn2+ на характер синтеза ДНК в экстрактах клеток: 1) нормальных тканей человека и мыши; 2) опухолей человека (увеальная меланома глаза); 3) опухолевых культур человека (SKOV-3 и HL-60). В каждой группе обнаружены характерные особенности и закономерности Mn-зависимого синтеза ДНК. Описаны изменения в Mn-зависимом синтезе ДНК, происходящие при трансформации клетки из нормальной в опухолевую. Также показано, что ошибочный синтез ДНК, катализируемый Pol i, в экстрактах всех типов клеток эффективно подавляется с помощью ранее нами полученного РНК-аптамера к Pol i, названного IKL5. Полученные результаты могут стать основой использования данного аптаме-ра как потенциальное средство для подавления повышенной активности Pol i в опухолевых клетках.

Ключевые слова: ДНК-полимераза йота, меланома, ап-тамер, мутагенез

Pol i относится к Y-семейству ДНК-полимераз, все члены которого принимают участие в синтезе ДНК на поврежденных и модифицированных участках, так называемом синтезе через повреждение (TLS) [20, 31]. Однако из-за структурных особенностей каталитического центра данных репаративных ДНК-полимераз они по сравнению с репликативными ДНК-полимеразами при синтезе ДНК на неповрежденных матрицах допускают ошибки намного чаще [12, 25]. Данный конфликт пользы (преодоление блока репликации и поддержание стабильности генома) и вреда (высокая частота ошибок синтеза, приводящая к мутациям, error-prone synthesis) в нормальных клетках разрешается жесткой регуляцией функционирования данной группы ферментов как на уровне транскрипции, так и на посттрансляционном уровне. Так, показано, что Pol i взаимодействует с ДНК-полимеразой П и с Revl, и такое взаимодействие обеспечивает попадание данного белкового комплекса к поврежденному участку ДНК [15, 28]. Также важными факторами участия Pol i в процессах репарации ДНК служат взаимодействия как с ядерным антигеном проли-ферирующих клеток (PCNA), так и с фактором экс-цизионной репарации оснований XRCC1 [13, 30]. В связи с этим данное исследование имело целью выяснить, в какой мере сложный комплекс имеющихся в клетке регуляторных факторов влияет на активность Pol i в экстрактах нормальных и опухолевых клеток. Особый интерес также представляло изучение происходящих при злокачественной трансформации клеток

изменений в синтезе ДНК: интенсивность включения и точность встраивания нуклеотидов.

Известно, что все ДНК-полимеразы для своего функционирования требуют присутствия двухвалентных катионов [19, 21, 32]. Преобладание в клетке концентрацией Mg2+ над концентрацией других двухвалентных катионов служило основанием предполагать, что именно Mg2+ является основным кофактором для синтеза ДНК in vivo. Однако для гомогенного препарата Pol i предпочтительным активирующим кофактором является Mn2+, присутствие которого в реакционной среде намного сильнее повышает каталитическую активность этого фермента, чем присутствие любого другого двухвалентного катиона [11]. Тем не менее остается неясным, как активация Pol i Mn2+ реализуется в живой клетке в присутствии содержащихся там разнообразных регуляторных факторов. Изучение влияния Mn2+ на активность Pol i в экстрактах клеток может позволить в определенной мере решить этот вопрос.

Одной из характерных особенностей Pol i является способность встраивать некорректный G напротив T-матрицы даже в присутствии избытка корректного нуклеотида, dATP [17, 35]. Данное уникальное свойство лежит в основе misGvA-метода [1, 2], который позволяет выявлять активность Pol i в экстрактах клеток органов и тканей млекопитающих. Ошибочную ДНК-полимеразную активность Pol i можно отличить от активности других ДНК-полимераз экстрактов клеток благодаря уникальной способности фермента предпочтительнее включать G напротив T-матрицы и различию в электрофоретической подвижности между продуктами элонгации праймера, произведенными Pol i и другими ДНК-полимеразами [1, 2]. Подтверждением корректности misGvA-метода служил тот факт, что экспрессия Pol i человека в клетках дрожжей дает характерный продукт на электрофореграм-ме, в то время как в контрольных клетках дрожжей он отсутствовал [23]. Однако не стоит забывать о том, что набор ДНК-полимераз и регуляторных факторов у дрожжей и у человека сильно отличается. Кроме того, из данных литературы известно, что регуляция активности многих ферментов человека осуществляется по-разному в нормальных и в злокачественных клетках [14, 24, 27]. В связи с этим еще одной нашей задачей было выяснение того, выявляется ли с помощью misGvA-метода продукт активности именно Pol i; как в нормальных, так и в опухолевых тканях; способны ли другие ДНК-полимеразы экстрактов нормальных

ЭKCПЕРИMЕHТAЛЬHЫЕ СТАТЬИ

или опухолевых клеток в значимом количестве образовывать продукт с некорректно включенным G напротив T-матрицы. Решением данного вопроса, на наш взгляд, является специфическое функциональное выключение Pol i с помощью аптамера именно в экстрактах клеток человека. В данном случае весь набор ДНК-полимераз, за исключением ингибированной Pol i, продолжал бы функционировать, и результаты анализа электрофореграмм с продуктами синтеза дали бы ответ на поставленные вопросы.

Материалы и методы

Образцы клеток и тканей. Линия клеток SCOV-3 была любезно предоставлена Г.А. Посипановой (Московский НИИ медицинской экологии), а линия клеток HL-60 была получена из Российской коллекции клеточных культур (Санкт-Петербург). Обе клеточные линии культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 2 мМ L-глютамина, эмбриональную сыворотку телят (PAA Laboratories) в концентрации 10% для клеток SCOV-3 и 20% для клеток HL-60 и 50 мкг/мл гентами-цина, при 37oC в С02-инкубаторе, содержащем 95% воздуха и 5% CO2.

Для изучения ДНК-полимеразной активности в экстрактах клеток органов и тканей нормальных животных использовали мышей линии C57BL, у которых были проанализированы экстракты клеток головного мозга, печени и селезенки.

В качестве нормальной ткани человека использовали хориоидею глаза, а в качестве опухолевой ткани человека -увеальную меланому глаза. Хориоидеи взяты как из глаз, пораженных опухолью, так и из удаленных в результате травм глаз. Всего проанализировали 10 меланом от 10 пациентов и 15 хориоидей от 15 пациентов.

Приготовление экстрактов клеток. Для получения экстрактов брали образцы исследуемых тканей и измельчали их на льду тефлоновым гомогенизатором в 1X PBS, pH 7.4 (Helicon, Россия). Объем буфера брался исходя из расчета 1 мкл буфера на 1 мг гомогенизируемой ткани. Полученный го-могенат центрифугировали при 4°C в течение 10 мин при 14 000 д. Супернатант использовался в качестве ферментного препарата. Концентрацию белка измеряли с использованием реагента Protein Assay (BioRad США) и доводили до 5 мг белка на 1 мл.

Субстрат для определения активности Pol ъ В качестве субстрата для определения активности ДНК-полимераз использовали два комплементарных дезоксирибоолигонуклеотида: 17-членный праймер 5′-GGAAGAAGAAGTATGTT-3′ и 30-членную матрицу 5′ -CCTTCTTCATTCTAACATACTTCTTCTTCC-3′, которые при гибридизации образуют дуплекс с выступающим 5′-концом [37]. Мечение праймера с 5′-конца проводили с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4 (10 единиц) и 2 МБк [у-32Р] ATP в 70 мМ Tris-HCl-буфере, рН 7,6, содержавшем 10 мМ MgCl2 и 5 мМ дитиотреитола (ДТТ), при 37°C в течение 30 мин. После этого проводили инактивацию фермента при 70°C в течение 10 мин. Субстрат для ферментативной реакции получали после отжига в 200 мкл 10 пмоль меченого праймера с 15 пмоль матрицы в буфере для ПНК с добавлением NaCl до 100 мМ при 73°C в течение 3 мин и с последующим охлаждением до комнатной температуры.

Определение ДНК-полимеразной активности. Активность Pol i измеряли с использованием misGvA-метода, описанного нами ранее [1, 2] и позволяющего тестировать активность этого фермента в присутствии других ДНК-полимераз (например, в экстрактах клеток). Метод основан на разнице в электрофоретической подвижности между праймером, достроенным Pol i, и праймером, достроенным другими ДНК-полимеразами.

Реакцию проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержавшей 50 нМ субстрата с меченым праймером, 50 мМ Tris-HCl, рН 8, 0,2 мМ MnCl2, по 0,5 мМ dATP и dGTP и 3 мкл экс-

тракта соответствующего образца. Смесь инкубировали при 37°C 5 мин для экстрактов клеток органов мышей и 20 мин для экстрактов клеток органов человека. Реакцию останавливали охлаждением во льду с последующим добавлением равного объема смеси для нанесения образцов на полиакрила-мидный гель (95% формамид с 0,05% ксиленцианолом и 0,05% бромфеноловым синим). Электрофорез продуктов реакции осуществляли в l8% ПААГ с 7 M мочевиной в Tris-боратном буфере при силе тока l5 мА (до начала выхода из геля бром-фенолового синего). После электрофореза гель выдерживали в течение l0 мин в фиксирующем растворе, содержавшем l0% уксусную кислоту, 30% этиловый спирт и l% глицерин, затем высушивали и радиоавтографировали в течение суток. Автограф сканировали на фосфоимиджере Storm 840 (Amersham Biosciences, США). Данные анализировали с помощью программы Image Quant 5.2.

Относительное включение G напротив T-матрицы (MoG — Misincorporation of G) рассчитывали по формуле MoG = ((d + c + b + a) • l00%)/ (4D +d) + 3(C + c) + 2(B + b) + (A + a)), где A, B, C и D- интенсивность полос на электрофореграмме, соответствующих продуктам, генерируемым корректными ДЖ-полимеразами +l(l8A), +2(l9G), +3(20A) и + 4(2lA), тогда как a, b, c, и d — интенсивность полос +l*(l8G), +2*, +3* и +4*, соответствующих олигонуклеотидам с отличающейся электрофоретической подвижностью, образующимся в результате продолжения синтеза ДЖ! после +l* продукта Pol i.

Приготовление препарата аптамера IKL5 для добавления в ДНК-полимеразную реакцию. РЖ! аптамер IKL5 был синтезирован в РЖ!-полимеразной реакции in vitro, как описано ранее [l8]. Синтезированный аптамер был очищен денатурирующим электрофорезом в ПААГ [9]. После элюции из полиа-криламидного геля и осаждения этанолом аптамер растворяли в l00 мM NaCl. Для рефолдинга аптамера смесь инкубировали 3 мин при 73°C с последующим постепенным охлаждением до комнатной температуры. Kонцентрацию аптамера измеряли с использованием спектрофотометра NanoDrop l000 (Thermo Fisher Scientific, США).

Изучение ингибирующего действия аптамера IKL5 на активность Pol i в экстрактах клеток. Для изучения влияния аптамера IKL5 на активность ДЖ!-полимераз в экстрактах клеток аптамер прединкубировалипри 25°С l0 мин с 3 мкл экстракта клеток в l5 мкл смеси, содержавшей 50 мM Tris-HCl, pH 8, l единицу ингибитора РЖ!аз (Fermentas), 0,2 мM MnCl2, а также по 0,5 мM dATP и dGTP. После этого к смеси добавляли радиоактивно меченный олигонуклеотидный субстрат до концентрации 50 hM и полученную cмесь инкубировали 20 мин при 37°С с последующим перенесением в баню со льдом и добавлением смеси для нанесения образцов на полиакриламидный гель (95% формамид с 0,05% ксиленцианолом и 0,05% бромфеноловым синим).

Результаты и обсуждение

Влияние концентрации Mn2+ на активность Pol i в экстрактах нормальных клеток человека и мыши. С целью изучения влияния концентрации Mn2+ на активность Pol i в экстрактах нормальных клеток были поставлены реакции элонгации радиоактивно меченного праймера. Реакции проводили в ряде реакционных смесей, содержащих Mn2+ от l0 до 200 мкM в виде соли хлора. В данном интервале концентраций находятся как оптимум для гомогенного препарата фермента, так и физиологическая концентрация Mn2+ в клетке [3, ll, 33].

Продукт активности Pol i в большинстве исследованных нормальных тканей мыши и человека проявляется уже с l0 мкM Mn2+ (рис. l). Однако в некоторых органах, например в селезенке мыши, продукт активности Pol i отмечается лишь при концентрации

Mn2+ 50 мкМ и выше. Незначительное увеличение количества продуктов активности Pol i во всех органах можно наблюдать лишь в промежутке от 10 до 50 мкМ Mn2+. Также из рис. 1 видно, что активность Pol i, достигнув максимума при 50-100 мкМ Mn2+, при дальнейшем повышении концентрации этого иона не изменяется, оставаясь на плато.

Одной из особенностей Pol i является наличие такого явления, как Т-стоп [35, 37]. Его суть заключается в остановке синтеза продукта, в который Pol i включила некомплементарный G напротив Т-матрицы. Как видно на рис. 1, подобное явление обнаруживают в экстрактах клеток всех нормальных тканей млекопитающих вне зависимости от концентрации Mn2+. В результате электрофореза продуктов синтеза двойную полосу выявляют только в районе 18-членного олигонуклеотида, где продукт Pol i, содержащий G на З’-конце, движется медленнее 18-членных продуктов других ДНК-полимераз, на З’-конце которых включен А.

Влияние концентрации Mn2+ на активность Pol i в экстрактах клеток увеальной меланомы человека. Реакция элонгации радиоактивно меченного праймера в экстрактах клеток меланом в зависимости от концентрации Mn2+ в реакционной смеси показала картину, во многом отличающуюся от наблюдаемой в экстрактах клеток нормальных тканей (рис. 2, а). Тем не менее так же как и в нормальных тканях, продукт активности Pol i начинает отмечаться при концентрации Mn2+ 10 мкМ, и активность фермента также выходит на плато при 50-100 мкМ. Однако в экстрактах клеток меланом относительная доля продуктов Pol i крайне высока и достигает порядка 60% (см. рис. 2, а, б). Еще одной отличительной особенностью является то, что при концентрации Mn2+ 50 мкМ и выше в экс-

Рис. 1. Влияние концентрации Mn2+ на ДНК-полимеразную активность в экстрактах клеток нормальных тканей человека и мыши. Электрофореграмма продуктов синтеза в экстрактах: а — органов мышей; б — хориоидеи человека; в -относительная активность Pol i (вычислена на основании электрофореграмм а, б).

трактах клеток меланом начинает отмечаться феномен преодоления Т-стопа (см. рис. 2, а). Этот феномен описан нами ранее и представляет собой одну из характеристик опухолевой ткани, отличающую данный синтез ДНК от синтеза в нормальной ткани [2]. В данном случае на электрофореграмме мы можем наблюдать сразу несколько двойных полос. Наличие верхних полос в области 19- и 20-членных продуктов свидетельствует о функционировании механизма достройки продуктов синтеза с некорректно включенным нуклеотидом.

Изменения в Mn-зависимом синтезе ДНК, происходящие при злокачественной трансформации клетки. На рис. 2в представлена типичная картина Mn-зависимого синтеза ДНК, осуществляемая в экстрактах клеток хориоидеи (дорожка 1) и меланомы (дорожка 2), взятых от одного и того же пациента. Количество белка в обоих экстрактах и условия проведения реакции идентичны. Результаты анализа электрофореграмм показали, что в экстрактах клеток меланомы происходит усиление общего синтеза ДНК в 6 раз по сравнению с таковым синтеза в экстрактах клеток хориоидеи. Эти различия обусловлены в основном значительно возросшей активностью Pol i. Количество ее продуктов увеличивается в 10-12 раз, в то время как количество продуктов корректных ДНК-полимераз увеличивается лишь в 4 раза.

Влияние концентрации Mn2+ на активность Pol i в экстрактах клеток человеческих опухолевых линий SKOV-3 и HL-60. Реакция элонгации радиоактивно меченного праймера в зависимости от концентрации Mn2+ в экстрактах опухолевых клеток SKOV-3 и HL-60 выявила паттерн синтеза ДНК, отличный как от полученного с экстрактами клеток нормальных тканей, так и от полученного с экстрактами клеток меланом (рис. 3). Подобно экстрактам клеток мела-ном, экстракты клеток данных линий также характеризуются преодолением Т-стопа. В то же время достаточно низкая относительная доля продукта Pol i (14-16%) и отсутствие активности исследуемого фермента при концентрации Mn2+ 10 мкМ делают данный паттерн похожим на наблюдаемый в экстрактах клеток нормальных тканей. Также стоит отметить, что экстракты клеток обеих опухолевых линий демонстрируют в целом сходную картину синтеза ДНК. Характерной чертой экстрактов данных клеток является достижение максимума активности Pol i при концентрации Mn2+ 200-250 мкМ.

Таким образом, мы провели исследование зависимости активности Pol i от концентрации Mn2+ в экстрактах клеток нормальных тканей, меланом и опухолевых линий SKOV-3 и HL-60. В результате можно отметить, что в каждом из проанализированных случаев мы имеем дело с определенным вариантом синтеза ДНК. Они

Рис. 2. Влияние концентрации Mn2+ на ДНК-полимеразную активность в экстрактах клеток увеальной меланомы человека. а — электрофореграмма продуктов синтеза; б — относительная активность Pol i (вычислена на основании электрофореграммы а); в — сравнение ДНК-полимеразной активности экстрактов клеток хориоидеи (дорожка 1) и увеальной меланомы (дорожка 2) человека.

различаются по интенсивности misGvA-синтеза, общей ДНК-полимеразной активности и способности преодолевать Т-стоп (см. таблицу).

Влияние аптамера IKL5 на интенсивность образования продуктов с некорректно встроенным G напротив T-матрицы в экстрактах нормальных и опухолевых клеток человека. Как было описано выше, в экстрактах нормальных и опухолевых клеток человека в зависимости от концентрации Mn2+ образование продуктов с некорректно встроенным G напротив T-матрицы происходит по-разному. Данный факт может указывать как на функционирование в разных типах тканей различных регуляторных факторов, по-разному влияющих на активность Pol 1, так и на возможное участие в образовании продукта с некорректно встроенным G разных ДНК-полимераз. Для выяснения данного вопроса мы поставили эксперименты по изучению влияния полученного нами ранее РНК-аптамера к Pol i на синтез ДНК в экстрактах клеток человека [18]. Для этого мы проводили реакцию элонгации радиоактивно меченного праймера в присутствии 1 мкМ аптамера IKL5. Добавление аптамера в реакционную смесь, содержащую экстракт клеток меланомы, приводит к значительному, почти полному, исчезновению продуктов с некорректно включенным G напротив T-матрицы (рис. 4). Количество продуктов с некорректно встроенным G в присутствии ап-тамера даже на 20 мин реакции значительно меньше, чем количество данных продуктов без аптамера после 1 мин.

Затем мы изучили влияние аптамера IKL5 на синтез ДНК в экстрактах клеток как SKOV-3 и HL-60, так и в экстрактах клеток хориоидеи. На рис. 5 видно, что во всех случаях добавление аптамера приводит к исчезновению верхних полос (продуктов с некорректно встроенным нуклеотидом) в районе 18-, 19- и 20-членных продуктов элонгации праймера. В то же время стоит отметить, что интенсивность полос, соответствующих продуктам активности других ДНК-полимераз, остается неизменной.

В данной работе мы впервые исследовали влияние близких к физиологическим концентраций Mn2+ на активность Pol i в экстрактах нормальных и опухолевых клеток человека и мыши. Mn2+ является наиболее эффективным кофактором Pol i, и наличие этого иона в реакционной среде позволяет выявить активность Pol

i в экстрактах клеток большинства тканей как человека, так и млекопитающих [2, 11]. Стоит отметить, что в присутствии Mn2+ способны эффективно работать и некоторые другие ДНК-полимеразы, в частности ДНК-полимераза ß, ДНК-полимераза ц и ДНК-полимераза X. Однако оптимум их активности in vitro проявляется при концентрации Mn2+ 0,1-1 мМ, что значительно выше физиологических значений в клетке [6, 10, 36].

В результате данного исследования мы выявили несколько вариантов Mn-зависимого синтеза ДНК. Характерные для каждого варианта признаки обобщены в таблице. Первый вариант Mn-зависимого синтеза ДНК обнаруживается в экстрактах клеток нормальных тканей и характеризуется достаточно корректным синтезом ДНК с низкой долей активности Pol i и отсутствием преодоления Т-стопа. Второй вариант Mn-зависимого синтеза ДНК наблюдается в экстрактах клеток увеальных меланом и характеризуется крайне интенсивным ошибочным синтезом. Доля продукта Pol i достигает 60% суммарного продукта синтеза ДНК. Еще один вариант Mn-зависимого синтеза ДНК обнаружен в экстрактах клеток человеческих опухолевых линий SKOV-3 и HL-60. Максимум активности Pol i в экстрактах этих клеток достигается при значительно большей концентрации Mn2+, чем в двух первых вариантах Mn-зависимого синтеза. По-видимому, это обусловлено различиями в регуляторных факторах, контролирующих синтез ДНК.

Стоит отметить, что во всех исследованных экстрактах клеток активность Pol i, после достижения максимума при определенной концентрации Mn2+, выходила на плато и при дальнейшем повышении концентрации данного иона не изменялась. Данное поведение Pol i кардинально отличается от поведения гомогенного препарата этого фермента. Так, согласно данным литературы, активность гомогенного препарата Pol i после достижения максимума в ответ на дальнейшее повышение концентрации Mn2+ резко снижается [11]. Все это, а также те многочисленные различия в активности Pol i в экстрактах нормальных и опухолевых клеток наглядно показывают ту значи-

Основные характеристики Mn-зависимого синтеза ДНК в экстрактах нормальных и опухолевых клеток человека

Нормаль- Опухоль: Опухолевые

Характеристика ная ткань: хориои- увеаль-ная ме- клеточные линии: SKOV-3

дея ланома и HL-60

Концентрация Mn2+, при

которой активность Pol г 50-100 50-100 200-300

достигает максимума, мкМ

Доля активности Pol г от

суммарной активности 15-18 55-65 15-20

синтеза ДНК, %

Преодоление Т-стопа Нет Есть Есть

Суммарная активность синтеза ДНК Низкая Высокая Высокая

Рис. 3. Влияние концентрации Mn2+ на ДНК-полимеразную активность в экстрактах клеток опухолевых линий человека SKOV-3 и HL-60.

Электрофореграмма продуктов синтеза в экстрактах: а — клеток SKOV-3, б — клеток HL-60; в — относительная активность Pol i (вычислена на основании электрофореграммы а); г — относительная активность Pol i (вычислена на основании электрофореграммы б).

тельную роль, которую занимает сложный комплекс имеющихся в клетке регуляторных факторов в регуляции активности Pol i.

Как известно, увеальная меланома образуется из клеток хориоидеи. В связи с этим сравнение синтеза ДНК в обоих типах тканей, взятых от одних и тех же людей, дает адекватную картину тех количественных и качественных изменений в Mn-зависимом синтезе ДНК, которые осуществляются в клетке при злокачественной трансформации. Как показали результаты анализа электрофореграмм, основными изменениями в синтезе ДНК при злокачественной трансформации являются крайне возросшая активность Pol i и появление способности преодолевать Т-стоп. Ранее мы проводили оценку количества Pol i методом Вестерн-блоттинга в экстрактах хориоидеи и увеальной ме-ланомы [16]. Показано, что в экстрактах хориоидеи Pol i не определяется, а в экстрактах меланомы наблюдается отчетливая полоса. Это позволяет сделать вывод о том, что сильно возросшая активность Pol i в экстрактах клеток меланом по крайней мере частично обусловлена резким усилением экспрессии данного фермента, произошедшим при злокачественной трансформации клеток. В то же время появление феномена преодоления Т-стопа может говорить о значительных изменениях в комплексе регуляторных факторов, что, по-видимому, вызывает ослабление контроля над высокоошибочными репаративными ДНК-полимеразами и разбалансировку механизмов синтеза ДНК. Высокий ошибочный синтез ДНК, по крайней мере отчасти обусловленный активностью Pol i, может приводить к повреждениям и, как следствие, функциональным выключениям генов регуля-торных факторов, препятствующих бесконтрольному делению клетки, провоцируя тем самым злокачествен-

ную трансформацию клетки. Еще около 40 лет назад была сформулирована мутационная гипотеза возникновения рака, согласно которой ранние события канцерогенеза могут быть следствием генерации мутаций из-за нарушения точности работы механизмов репликации и репарации [22]. Показано, что одним из механизмов запуска мутагенеза в клетках могут являться дерегуляция и неконтролируемое повышение активности репаративных ДНК-полимераз. Ассоциация злокачественного перерождения клеток с нарушением активности таких ДНК-полимераз продемонстрирована на ряде примеров. Например, сверхэкспрессия ДНК-полимеразы ß характерна для опухолей яичников, простаты, молочных желез и пр. [5, 7, 34]. Сверхэкспрессия ДНК-полимеразы к ассоциирована с раком легких [4, 29].

В данной работе также продемонстрировано, что добавление аптамера IKL5, специфично ингибирующего Pol i [18], к экстрактам различных типов клеток приводит к полному или почти полному подавлению образования продуктов

Рис. 4. Влияние аптамера IKL5 на ДНК-полимеразную активность в экстрактах клеток меланомы. а — электрофореграмма продуктов синтеза; реакцию проводили в присутствии либо 1 мкМ аптамера IKL5 либо 1 мкМ исходного пула олиго-рибонуклеотидов (pool) в качестве контроля; время реакции варьировало от 1 до 20 мин; б — относительная активность Pol i (вычислена на основании электрофореграммы а).

Рис. 5. Электрофореграмма продуктов синтеза, отображающая влияние аптамера IKL5 на ДНК-полимеразную активность в экстрактах различных тканей. Время реакции 20 мин. Реакцию проводили в присутствии либо 1 мкМ аптамера IKL5 либо 1 мкМ исходного пула олигорибонуклеотидов (pool) в качестве контроля.

с некорректно встроенным G напротив T-матрицы. В связи с этим можно сделать вывод о том, что образование таких продуктов обеспечивается активностью именно Pol i, и ни одна другая ДНК-полимераза человека не способна в значимом количестве образовывать их в присутствии избытка комплементарного dATP. Данный результат служит дополнительным веским доказательством правомерности использования misGvA-метода для определения активности Pol i в экстрактах всех типов клеток.

Подавление высокоошибочной активности Pol i аптамером IKL5 в экстрактах как опухолевых, так и нормальных клеток позволяет надеяться на использование данного аптамера в качестве терапевтического средства. Следует учесть также, что эксперименты по ингибированию Pol i в экстрактах клеток проводили в оптимальных для этого фермента условиях. Очевидно, что в клетках, где концентрация Mn2+ намного ниже, ингибирующее действие аптамера будет более эффективным. Выключение Pol i на ранних стадиях онкоге-неза, возможно, снизило бы скорость мутагенеза и тем самым уменьшило вероятность приобретения одной клеткой необходимых для злокачественной трансформации мутаций, инактивирующих гены регуляторных белков и активирующих онкогены. В свою очередь, подавление активности Pol i уже в злокачественных опухолевых клетках могло бы привести к снижению адаптивности в ответ на воздействие терапевтических агентов. Преимуществом использования для данных целей аптамеров по сравнению, например, с антителами являются отсутствие иммунного ответа, низкая молекулярная масса, крайне высокая специфичность и возможность экспрессии непосредственно в клетке [8, 26].

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, гранты 10-04-01434-а и 10-04-00656-а, а также по контрактам с Минобрнауки 14.740.11.0121 и 14.740.11.0171.

Авторы выражают благодарность Б.О. Глотову и А.В. Макаровой (оба из Института молекулярной генетики РАН) за ценные советы при выполнении работы.

Сведения об авторах:

Институт молекулярной генетики РАН Лахин А.В. — аспирант, 123182 Москва, пл. Курчатова, 2; e-mail: lahin9@mail.ru

Ефремова А.С. — мл. науч. сотр. Макарова И.В. — науч. сотр.

Шрам С.И. — заведующий сектором нейрофармако-логии.

Тарантул В.З. — профессор, заведующий отделом вирусной и клеточной молекулярной генетики.

Генинг Л.В. — стар. науч. сотр., заведующий сектором развития методов молекулярной генетики.

Офтальмологическая клиническая больница Департамента здравоохранения Москвы

Гришина Е.Е. — профессор, главный врач.

ЛИТЕРАТУРА

1. Генинг Л. В., Гришина Е. Е., Петроченков А. Н., Тарантул В. З. Генетика. 2006; 42: 98-103.

2. Казаков А. А., Гришина Е. Е., Тарантул В. З., Генинг Л. В. Биохимия. 2010; 75: 1031-39.

3. Ash, D. E, Schramm V. L. J. Biol. Chem. 1982; 257: 9261-4.

4. Bavoux C., Leopoldino A. M., Bergoglio V. et al. Cancer Res. 2005; 65: P. 325-30.

5 Bergoglio V., PillaireM. J., Lacroix-TrikiM. et al. Cancer Res. 2002; 62: 3511-14.

6. Blanca G., Shevelev I., Ramadan K. et al. Biochemistry. 2003; 42: 7467-7476.

7. Canitrot Y., Cazaux C., FréchetM. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998; 95: 12586-90.

8. CerchiaL., deFranciscis V. Trends Biotechnol. 2010; 28: 517-25.

9. ConradR. C., Giver L., Tian Y., Ellington A. D. Methods Enzymol. 1996; 267: 336-67.

10. Domínguez O., Ruiz J. F., Lain de Lera T. et al. EMBO J. 2000; 19: 1731-42.

11. FrankE. G., Woodgate R. J. Biol. Chem. 2007; 282: 24689-96.

12. GoodmanM. F. Annu. Rev. Biochem. 2002; 71: 17-50.

13. Haracska L., Acharya N., Unk I. et al. Mol. Cell. Biol. 2005; 25: 1183-90.

14. HerlingA., KönigM., BulikS., HolzhütterH. G. FEBS J. 2011; 278: 2436-59.

15. Kannouche P., Fernández deHenestrosaA. R., CoullB. et al. EMBO J. 2003; 22: 1223-33.

16. Kazakov A. A., Makarova A. V., Grishina E. E. et al. Curr. Top. in Biochem. Res. 2010; 12: 39-49.

17. Kunkel T. A., Pavlov Y. I., BebenekK. DNA Repair (Amst). 2003; 2: P. 135-49.

18. Lakhin A. V., Kazakov A. A., Makarova A. V. et al. Nucl. Acids Ther. 2012; 22: 49-57.

19. Lehman I. R., Bessman M. J., Simms E. S., Kornberg A. J. Biol. Chem. 1958; 233: 163-70.

20. Lehmann A. R., Niimi A., Ogi T. et al. DNA Repair (Amst.). 2007; 6: 891-99.

21. Loeb L. A., Kunkel T. A. Annu. Rev. Biochem. 1982; 51: 429-57.

22. Loeb L. A., Springgate C. F., BattulaN. Cancer Res. 1974; 34: 2311-21.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

23. Makarova A. V., Grabow C., Gening L. V. et al. PLoS One. 2011; 6: e16612.

24. MarraM., Sordelli I. M. Lombardi A. et al. J. Transl. Med. 2011; 9: 171.

25. McCulloch S. D., Kunkel T. A. Cell Res. 2008; 18: 148-61.

26. Missailidis S., Hardy A. Expert Opin. Ther. Pat. 2009; 19: 1073-82.

27. Muñoz-Pinedo C., ElMjiyadN., Ricci J. E. Cell. Death Dis. 2012; 3: e248.

28. Ohashi E., Murakumo Y., Kanjo N. et al. Genes Cells. 2004; 9: 523-31.

29. O-Wang J., KawamuraK., Tada Y. et al. Cancer Res. 2001; 61: 5366-69.

30. Petta T. B., Nakajima S., ZlatanouA. et al. EMBO J. 2008; 27: 2883-95.

31. Prakash S., Johnson R. E., Prakash L. Annu. Rev. Biochem. 2005; 74: 317-53.

32. Sirover M. A., Loeb L. A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976; 70: 812-17.

33. Smeyers-Verbeke J., May C., DrochmansP., MassartD. L. Anal. Biochem. 1977; 83: 746-53.

34. SrivastavaD. K., HusainI., Arteaga C. L., Wilson S. H. Carcinogenesis. — 1999; 20: 1049-54.

35. Tissier A., McDonald J. P., Frank E. G., Woodgate R. Genes Dev. 2000; 14: 1642-50.

36. Wang T. S, EichlerD. C, Korn D. Biochemistry. 1977; 16: 4927-34.

37. Zhang Y, Yuan F., Wu X., Wang Z. Mol. Cell. Biol. 2000; 20: 7099-10.

nocTymna 05.09.12

EFFECT OF MN(II) ON THE ERROR-PRONE DNA POLYMERASE IOTA ACTIVITY IN EXTRACTS FROM HUMAN NORMAL AND TUMOR CELLS

A. V. Lakhin1, A. S. Efremova1,I. V. Makarova1, E. E. Grishina2, S. I. Shram1, V. Z. Tarantul1, and L. V. Gening1

1 Institute of Molecular Genetics, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia; 2 Ophthalmological Clinical Hospital, Moscow Department of Health, Moscow, Russia

The DNA polymerase iota (Pol i), which has some peculiar features and is characterized by an extremely error-prone DNA synthesis, belongs to the group of enzymes preferentially activated by Mn2+ instead of Mg2+. In this work, the effect of Mn2+ on DNA synthesis in cell extracts from a) normal human and murine tissues, b) human tumor (uveal melanoma), and c) cultured human tumor cell lines SKOV-3 and HL-60 was tested. Each group displayed characteristic features of Mn-dependent DNA synthesis. The changes in the Mn-dependent DNA synthesis caused by malignant transformation of normal tissues are described. It was also shown that the error-prone DNA synthesis catalyzed by Pol i in extracts of all cell types was efficiently suppressed by an RNA aptamer (IKL5) against Pol i obtained in our work earlier. The obtained results suggest that IKL5 might be used to suppress the enhanced activity of Pol i in tumor cells.

Key words: DNA polymerase iota, melanoma, aptamer, mutagenesis

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 616.831-005-036.11-054]:577.21.08

Т. В. Тупицына1*, Е. А. Бондаренко1, С. А. Кравченко3, П. Ф. Татарский3, И. М. Шетова2, Н. А. Шамалов2, С. М. Кузнецова4, Д. В. Шульженко4, В. И. Скворцова5, П. А. Сломинский1,

Л. А. Лившиц3, С. А. Лимборская1

сравнительный анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов F2, F5, GP1BA и ACE с риском развития инсульта в русской и украинской

популяциях

1ФГБУ науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук, Москва; 2ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития России, кафедра фундаментальной и клинической неврологии и нейрохирургии, Москва; 3Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев; 4Государственное учреждение Институт геронтологии им. Д. Ф. Чеботарёва НАМН Украины, Киев; 5Министерство здравоохранения Российской Федерации, Москва

Проведен сравнительный анализ ассоциаций между G20210A полиморфизмом гена F2, G1691A полиморфизмом гена F5, -5Т/С полиморфизмом гена GP1BA, инсерционно-делеционным (I/D) полиморфизмом гена ACE и риском развития инсульта в двух этнических выборках — русской и украинской популяциях. Показано, что в русской популяции у лиц с генотипом DD риск развития ишемического инсульта повышен (ОШ = 1,4, 95% ДИ [1,05; 1.78], р = 0,02), в то время как генотипы I/I и I/D ассоциированы с пониженным риском развития ишемического инсульта (ОШ = 0,7, 95% ДИ [0.56; 0,95], р = 0,02). В украинской этнической выборке различия в распределении частот генотипов и аллелей между больными с инсультом и лицами контрольной группы по данному полиморфному локусу не являются статистически достоверными и I/D полиморфизм гена ACE не ассоциирован с риском развития инсульта в украинской популяции (ОШ = 0,8, 95% ДИ [0,48; 1,32], р = 0,45). G20210A полиморфизм гена F2, G1691A полиморфизм гена F5, -5Т/С полиморфизм гена GP1BA не ассоциированы с риском инсульта в обеих этнических выборках.

Инсульт — сложное заболевание, характеризующееся множеством этиологических факторов, вовлеченных в его патогенез, и разнообразием клинических проявлений. Сочетание генетических и средовых

факторов определяет развитие той или иной формы инсульта, влияет на клиническую картину заболевания, его течение, тяжесть и исход. Ежегодно в России переносят инсульт более 450 тыс. человек, в мире эта цифра приближается к 6 млн, и в структуре общей смертности инсульт занимает второе место, уступая лишь кардиоваскулярной патологии [1].

Одним из основных пусковых факторов в каскаде патогенетических реакций, приводящих к развитию инсульта, является эндотелиальная дисфункция. Ее важнейшая причина — хроническая гиперактивация ренин-ангиотензин-альдостероновой системы, одним из главных компонентов которой является ангиотен-зинпревращающий фермент (ACE). В 16-м интро-не гена ACE был идентифицирован инсерционно-делеционный (I/D) полиморфизм, который заключается в наличии (аллель I) или отсутствии (аллель D) A/u-повтора [29]. Были охарактеризованы распределения частот генотипов и аллелей по этому полиморфному участку гена ACE в популяциях разных народов. Обнаружены межпопуляционные различия в распределении частот генотипов и аллелей по I/D полиморфизму гена ACE [6, 12, 14, 19].

Известно, что конечным этапом патогенеза атеросклероза при развитии цереброваскулярных заболеваний является формирование тромба. К тромбозу раз-