Ошибки при постановке пцр

Команда «Биокор Текнолоджи» разрабатывает тест-системы и наборы для молекулярной диагностики методом ПЦР, и расскажет в этом материале, на какие детали стоит обратить внимание для предотвращения ложноположительных и ложноотрицательных результатов.

ПЦР является универсальным методом лабораторной диагностики, позволяющим идентифицировать даже не собственно вирус или бактерию в биологическом материале, а участки их РНК или ДНК.

Чувствительность ПЦР-анализа приближается к 10-100 копиям генетического материала возбудителя на реакцию. Для сравнения, если человек находится в активной фазе развития заболевания, то его биологический материал содержит миллионы геномов возбудителя на миллилитр, что, после выделения нуклеиновой кислоты будет равно нескольким тысячам копий на реакцию.

В мире, и в Украине в частности, с начала эпидемии COVID-19 ведутся дискуссии относительно того, насколько надежной является такая методика. Одни источники говорят, что ошибочным может быть каждый четвертый тест, другие указывают, что количество ложноположительных и ложноотрицательных результатов составляет лишь несколько процентов. Учитывая актуальность темы, рассмотрим на примере ПЦР для диагностики COVID-19 по каким причинам могут возникать сомнительные или ошибочные результаты. Большинство указанных аспектов имеет место и в случае с ПЦР-тестированием других инфекционных заболеваний человека.

Особенности выбора места для взятия биологического материала

Такие возбудители, как SARS-CoV-2, способны поражать значительное количество органов. Для исследования на COVID-19 обычно берутся мазки из горла или носоглотки, где возбудитель в большом количестве находится ограниченное время — на 5-10 день от начала инфицирования, далее он спускается ниже — к бронхам и легким. Поэтому отрицательный результат ПЦР-теста не может исключать факта инфицирования пациента COVID-19.

С одной стороны, риски получить ложноотрицательный результат ПЦР-теста несколько возрастают на 1-7 день от начала инфицирования, когда количество вируса мало, а также на 10-30 день, когда, во-первых, COVID-19 уже «ушел» ниже, и, во-вторых, в организме уже присутствуют в достаточном количестве антитела, и размножение вируса более или менее эффективно сдерживается иммунной системой. С другой стороны, в некоторых случаях, мы можем получить сомнительно положительный результат ПЦР-теста даже на 60-й день от начала инфицирования, когда человек уже переболел, но в ее биологическом материале все еще можно найти обломки вируса. Все вышесказанное касается только некоторых отдельных случаев и не имеет характера «абсолютной закономерности».

Алгоритм тестирования регламентирован на государственном уровне и, если существует обоснованное подозрение на инфицирование COVID-19, для уточнения диагноза могут проводить ПЦР-анализ повторно.

Неправильное взятие биологического материала

Во избежание ложноположительных результатов вследствие загрязнения — попадание молекул ДНК/РНК из внешней среды, — клинический материал необходимо отбирать стерильными одноразовыми инструментами в одноразовые стерильные пробирки согласно установленным стандартам МОЗ. Взятие материала должны проводить медицинские работники, одетые в средства индивидуальной защиты.

Недостаточное количество биологического материала может привести к ложноотрицательным результатам исследования. В некоторых случаях, эту проблему можно отследить на этапе выделения нуклеиновых кислот или в процессе амплификации (при условии использованием в диагностических наборах для обнаружения SARS-CoV-2 внутреннего контроля, то есть фрагмента генома человека).

Несоблюдение температуры и сроков хранения

Учитывая возможность распада РНК в клиническом материале, сроки хранения и транспортировки должны быть минимальными. В идеальном случае все мазки нужно транспортировать в лабораторию в течение 24-48 часов с момента взятия в специальном транспортной среде при температуре плюс 4 °C. Транспортная среда должна содержать специальные реагенты — муколитики, обеспечивающие разрушение слизи, которая подавляет ПЦР. Если отсутствует возможность своевременно доставить образцы материалов в лабораторию, их можно замораживать до минус 70 °C, используя для этого твердую углекислоту — «сухой лед». Образцы можно хранить в лаборатории в течение недели при температуре минус 20 °C, или до месяца при температуре минус 70 °C. Критическим моментом является количество замораживаний/размораживаний образца: чем их больше, тем ниже качество образца и, вследствие этого, и чувствительность метода в целом.

В результате нахождения образцов в транспортной среде больше срока, рекомендованного производителем, происходит рост естественной бактериальной микрофлоры, которая обычно находится в ротовой полости человека, и разрушение молекул вирусной РНК в образце. При использовании специальных консервантов и стабилизаторов, биоматериал может храниться в температурном диапазоне в соответствии с инструкцией производителя сроком до месяца.

Выделение нуклеиновых кислот

ПЦР-исследование не проводится непосредственно на биологических образцах и требует предварительной пробоподготовки. На этом этапе большое значение имеет качество наборов для экстракции нуклеиновых кислот, которые должны обеспечить выделение образца соответствующей концентрации и степени очистки от примесей, подавляющие ПЦР. Из-за неправильного выбора набора также может быть потеряна часть или даже все РНК возбудителя, что может приводить к ложноотрицательным результатам. Качество и чистоту нуклеиновых кислот можно проверить с помощью специального аналитического прибора — спектрофотометра. Он есть во многих лабораториях, осуществляющих ПЦР-исследования.

Выделенную из образцов РНК можно хранить при температуре минус 20 °C до недели. Для более длительного хранения нужна температура минус 70 °C. Также можно использовать специальные реагенты, стабилизирующие РНК и предупреждают ее деградации (например, DEPC — диэтилпирокарбонат).

Амплификация

Процесс амплификации (увеличение копий участков ДНК, которые обычно содержат необходимые фрагменты целевых генов) может включать до 45 циклов, во время каждого из них количество копий удваивается. Он обеспечивается реагентами, которые входят в диагностические наборы для выявления SARS-CoV-2, и приборами, обеспечивающими циклическую смену температур — амплификаторами.

Для обеспечения корректных результатов, качество диагностических наборов является первоочередным требованием. Также лаборатории должны проводить процедуру их верификации, проведя сравнительные испытания с собственными панелями референтных образцов и решениями от других производителей. Наборы должны поступать в лаборатории в термобоксах с холодовыми блоками и храниться при температуре минус 20 °C. Несоблюдение условий их транспортировки или хранения приводит к повреждению компонентов наборов, и, вследствие того, к ложноотрицательным результатам. Чтобы предупредить эту ошибку, в состав каждого диагностического набора входит положительный контрольный образец, задачей которого является установление работоспособности реагентов.

Диагностические наборы должны быть совместимыми с амплификаторами, используемыми в лаборатории. Реагенты, входящие в состав набора, меченные различными флуоресцентными красителями. Детекция флуоресцентного сигнала от каждого красителя происходит в определенном диапазоне (на определенном «канале»). Если прибор имеет слабую чувствительность по определенным флуоресцентным каналам, это может приводить к ошибочным результатам. Во избежание ошибок работники лабораторий должны проверять исправность работы приборов, а также настройки параметров работы и протоколов амплификации.

Контаминация образцов

При несоблюдении мер безопасности в помещениях лаборатории могут накапливаться продукты амплификации. Это приводит к контаминации образцов, и, в общем итоге, к ложноположительным результатам. Для подтверждения отсутствия загрязнения, каждую серию ПЦР-исследований нужно сопровождать постановкой негативных контрольных образцов, включенных в состав диагностических наборов для выявления SARS-CoV-2.

Перекрестная контаминация может возникать из-за попадания аэрозольных частиц от соседнего образца, содержащего вирусную РНК, при внесении образцов в ПЦР-смесь. На этапе амплификации контаминированный образец издает слабый положительный результат, который означает, что в исследуемой пробе обнаружено очень малое количество вируса. Но такой результат также может указывать, что человека тестировали до наступления полного выздоровления и уровень вируса в его организме был низким.

Способы предупреждения контаминации — использование наконечников с фильтрами, химическая и ультрафиолетовая дезинфекция всех рабочих поверхностей, наличие отдельных наборов дозаторов, оборудования, халатов и перчаток для каждой зоны, проведения внутрилабораторного и внешнего контроля качества исследований — регламентированы на государственном уровне.

Другими эффективными, однако дорогостоящими мероприятиями для предотвращения контаминации является автоматизация этапов выделения нуклеиновых кислот и амплификации, а также двойной контроль — постановка каждого образца в двух параллельных реакциях.

Ошибки обработки данных

Расчеты результатов ПЦР в реальном времени проводятся с использованием компьютерных программ. Амплификатор в автоматическом режиме измеряет интенсивность флуоресценции в образцах на каждом цикле. Кривая амплификации имеет так называемую фазу экспоненциального роста, после которой следует фаза плато. Автоматическая интерпретация результатов не всегда дает правильный результат, поэтому рекомендуется проводить анализ кривых амплификации на предмет пересечения пороговых значений, и корректировать задачи пороговых значений по мере необходимости. Для большей достоверности можно сравнить такую ​​сомнительную кривую с кривой подтвержденного положительного образца.

Подытожим

На каждом этапе исследования являются условия, несоблюдение которых может привести к недостоверным результатам. Некоторые из потенциальных ошибок являются общими для большинства видов лабораторной диагностики (например, ошибки при взятии и хранения образца, настройка оборудования), тогда как другие являются специфическими только для этого вида исследования (например, контаминация образцов, низкое качество выделенных нуклеиновых кислот).

ПЦР — многостадийный метод, и для получения максимально достоверных и воспроизводимых результатов необходимо надлежащее выполнение каждого этапа процесса в соответствии со стандартами МОЗ и инструкциями производителей. Вторым важным условием является качество всех реагентов и расходных материалов, используемых в ПЦР: систем для сбора биологических материалов, наборов для выделения нуклеиновых кислот, диагностических наборов для выявления SARS-CoV-2.

Real-Time PCR: Как избежать ошибок

Ключевые факторы, оценка значения C_T, применение на практике

ПЦР в реальном времени (также известна как количественная ПЦР, real-time PCR, или qPCR) является простой и эффективной методикой количественного определения целевой последовательности ДНК в образцах. Зачастую, по причине крайней простоты освоения и выполнения данной методики, некоторые факторы, оказывающие критическое влияние на успешность метода, остаются без внимания. В этом обзоре мы рассмотрим ключевые факторы, которые необходимо учитывать при подготовке и интерпретации результатов real-time PCR.

Факторы, влияющие на C_T

C_T-величина (англ. Threshold cycle – пороговый цикл) – это значение количества циклов реакции, при котором кривая амплификации и прямая порога чувствительности прибора пересекаются (рис. 1B). Это значение является относительным показателем содержания ДНК-матрицы в образце, так как различия в количестве молекул матрицы в начале реакции влияют на количество циклов, необходимых для поднятия уровня флуоресценции выше уровня шума. Кроме того, на абсолютное значение C_T влияет множество других факторов, которые не зависят от изначального количества ДНК-матрицы в реакции. В данной статье мы обсудим самые часто встречаемые факторы, влияющие на значение C_T и выясним, как правильно оценивать эффективность прохождения real-time PCR.

На рисунке 1 изображены некоторые параметры кривой амплификации. Экспоненциальная фаза на рисунке 1B соответствует линейной фазе кривой на рисунке 1C. На рисунке 1C пороговое значение должно пересекать линейный участок кривой амплификации. Значение C_T обратно пропорционально количеству ДНК-матрицы в реакции, то есть чем меньшее количество ДНК-матрицы находится в реакционной смеси, тем большее количество циклов необходимо для достижения порогового количества продукта амплификации. Однако любые изменения в составе реакционной смеси или настройках детектора флуоресценции могут оказывать влияние на значение C_T. Соответственно, значение C_T для реакций, которые были проведены при разных условиях или в которых были использованы разные реактивы, не могут быть непосредственно сравнены друг с другом.

Рисунок 1:  A: Значение Rn представляет собой отношение интенсивности флуоресценции репортерного красителя к интенсивности флуоресценции референтного красителя. Другими словами, Rn – это репортерный сигнал, нормализованный к сигналу ROXÔ. На этом рисунке ось X отображает номер цикла ПЦР, ось Y – значение Rn.

B: Значение ΔRn представляет собой разницу значений Rn и базовой линии. На этом рисунке ось X отображает номер цикла ПЦР, ось Y – значение ΔRn.

C: График кривой амплификации представлен в виде логарифмической функции Log(ΔRn) от номера цикла.

Влияние компонентов реакционной смеси

Интенсивность флуоресценции каждой молекулы зависит от внешних факторов, к ним относятся, например, pH или концентрации солей в реакционной смеси. На рисунке 2 изображён график флуоресценции зонда TaqMan® в двух различных реакционных смесях. Обратите внимание, что интенсивность флуоресценции в реакционной смеси A выше, несмотря на одинаковую концентрацию ДНК-матрицы, зонда и красителя ROX™ в обеих смесях.

Рисунок 2: Пики флуоресценции, полученные при анализе двух разных реакционных смесей с одинаковым количеством ROX™. Различия в значении сигналов обусловлено составом реакционных смесей. На этом рисунке ось X отображает длину волны флуоресценции, ось Y – интенсивность свечения флуорофора.

В результате, значение ΔRn будет различным, это отображено на рисунке 3. Обратите внимание, что базовые линии для двух реакционных смесей различны (рисунок 3А). Различие в значении C_T не отображает общую производительность реакционной системы (рисунок 3B). Реакционные смеси с эквивалентными показателями чувствительности могут иметь различные абсолютные значения C_T.

На рисунке 3 в реакционных смесях A и B была проведена амплификация гена РНКазы P человека. В обеих образцах было использовано одинаковое количество геномной ДНК. На рисунке 3A показана зависимость Rn от номера цикла и базовые линии для обеих реакций. На рисунке 3B показана зависимость значения Log (ΔRn) от номера цикла. Значение порога чувствительности (зеленая прямая) одинаково для обеих реакций. Пороговый цикл C_T для реакционной смеси B (C_TB) наступает раньше, чем для реакционной смеси A (C_TA) при одинаковом количестве ДНК-матрицы в обеих образцах.

Пассивный референтный краситель ROX™

Величина Rn представляет собой отношение интенсивности флуоресценции красителя FAMÔ к  флуоресценции красителя ROX. Таким образом, если концентрация красителя ROX будет меньше, а концентрация FAM останется неизменной, величина Rn будет выше. Это приведет к тому, что значение базовой линии станет выше, и вследствие этого, ΔRn будет меньше, что в конечном итоге приведет к другому значению C_T. Различие в значениях C_T при уменьшенных концентрациях ROX не является показателем увеличения чувствительности реакции, при этом могут появиться другие нежелательные последствия. Низкая концентрация ROX в реакционной смеси может привести к увеличению стандартного отклонения значения C_T, как показано на рисунке 4. Чем больше стандартное отклонение, тем менее достоверны данные, особенно если есть необходимость детектировать небольшие различия концентрации целевой последовательности ДНК. (Более подробно это описано в разделе Точность).

На Рисунке 4. В трех реакционных смесях с различным содержанием ROX™ была проведена амплификация Трансформирующего ростового фактора бета (TGF beta). На рисунке 4A изображено значение C_T, на рисунке 4B изображено стандартное (среднеквадратическое) отклонение. Чем меньше концентрация ROX, тем раньше наступает пороговый цикл, но это увеличивает стандартное отклонение.

Эффективность ПЦР

Степень эффективности полимеразной цепной реакции тоже влияет на величину C_T. Сравнивая серии разведений, амплифицированых в условиях низкой и высокой эффективности реакции, мы обнаружим, что кривые амплификации имеют разный угол наклона. На рисунке 5, два образца (X и Y), амплифицированые в условиях низкой и высокой эффективности реакции, показывают различные значения C_T при одной и той же концентрации ДНК-матрицы. В этом примере, кривая амплификации при высокой эффективности реакции (синий график на рисунке 5) дает более низкое значение C_T при высокой концентрации ДНК-матрицы, хотя она имеет более высокую чувствительность при низкой концентрации ДНК-матрицы.

Рис. 5. Синяя стандартная кривая отображает 100% эффективность реакции (наклон -3,3). Зеленая стандартная кривая отображает 78% эффективность реакции (наклон -4). При амплификации Y молекул ДНК-матрицы в условиях низкой эффективности реакции пороговый цикл наступает раньше, чем в условиях высокой эффективности реакции. При меньшем количестве молекул ДНК-матрицы происходит наоборот – при низкой эффективности реакции пороговый цикл наступает позже, чем в условиях высокой эффективности реакции.

Эффективность ПЦР зависит от типа анализа, качества реакционной смеси и качества ДНК в образце. Как правило, эффективность реакции 90-110% считается приемлемой.

Различие в значении C_T для двух образцов может достоверно свидетельствовать о различной концентрации ДНК-матрицы в этих образцах только при условии одинаковых настройках оборудования, реактивов и типа анализа. Однако, если анализ был проведен на разном оборудовании, были использованы разные реактивы, праймеры или зонды, либо реакции проводились в разных объемах – различия в значениях C_T не дадут нам достоверной информации. Следовательно, абсолютные значения C_T имеет смысл сравнивать только в том случае, если все условия реакции были абсолютно одинаковыми.

Как оценить эффективность ПЦР в реальном времени

В случае, если какие-либо условия эксперимента были изменены (например, анализ проводился на разном оборудовании или в разных реакционных смесях), необходимо учитывать следующие параметры.

Динамический диапазон

 Для того, чтобы точно оценить эффективность реакции, необходимо провести, как минимум, 3 повторения реакции при концентрации ДНК-матрицы 5 log (10⁵ копий ДНК-матрицы на образец). Причина такой необходимости проиллюстрирована на рисунке 6. На нем отображено изменение угла наклона графика зависимости величины C_T при различных градиентах разведения ДНК-матрицы (1 log и 5 log). То есть, если мы будем проводить тестирование серии разведений при концентрации 1 log, и получим показатель 100% эффективности реакции, в реальности, разброс данного показателя будет находится в диапазоне 70-170%. Делая тот же самый тест при концентрации ДНК-матрицы 5 log, потенциальный разброс будет составлять всего ± 8%. То есть, если мы получили значение, например, 94% эффективности (при концентрации 5 log), то действительная эффективность реакции будет в диапазоне 88-100%. Из этого можно сделать вывод, что определять эффективность реакции необходимо при концентрации ДНК-матрицы 5 log. Уклон графика -3,3 ± 10% свидетельствует о 100%  ± 10% эффективности полимеразной цепной реакции. Более низкие значения эффективности ПЦР свидетельствуют о низкой чувствительности метода при данных условиях.

На Рисунке 6 точный расчет эффективности реакции, сделанный на основе серии разведений ДНК-матрицы. Для двукратного разведения на 5 точках (оранжевый) потенциальный разброс значений выше, чем для десятикратного разведения на 5 точках (синий).

Значение R²

Еще одним параметром, без которого невозможно точно рассчитать эффективность реакции, является коэффициент детерминации (R²). В математической статистике этот параметр показывает, насколько точно мы можем спрогнозировать значение некой величины, зная другую. Если R²=1, тогда можно точно установить корреляцию величины X (количество ДНК-матрицы) к Y (значению C_T) (рисунок 7A). Если R²=0, тогда невозможно определить корреляцию величины X к величине Y (рисунок 7B). Значение R²>0,99, в целом, обеспечивает достаточную точность определения корреляции.

На Рисунке 7 пример расчета R² для двух прямых. A: между x и y нет прямой корреляции. B: между x и y есть прямая корреляция.

Точность

Наиболее используемым способом расчета точности метода является вычисление стандартного отклонения (квадратный корень из вариансы). Если множество результатов имеют небольшой разброс относительно средней величины, тогда стандартное отклонение имеет малое значение, если же разброс велик, то стандартное отклонение больше.

На практике, большая выборка представляет собой распределение, близкое к нормальному. Это следствие центральной предельной теоремы, она гласит, что суммы многих независимых, одинаково распределенных случайных величин стремятся к нормальному распределению как к пределу. На рисунке 8А значения распределены таким образом, что 68% из них находятся в пределах одного стандартного отклонения, 95% – в пределах 2 стандартных отклонений, и 99,7% находится в пределах 3 стандартных отклонений.

Если эффективность ПЦР составляет 100%, то есть одно значение C_T, которое находится в пределах средних значений двукратного разведения (рисунок 8B). Для того чтобы определить количество ДНК-матрицы в диапазоне двукратных разведений в 99,7% случаев, стандартное отклонение должно быть ≤0,167. Чем больше стандартное отклонение, тем меньше вероятность достоверно найти разницу между образцами. Чтобы найти разницу между образцами в диапазоне двукратных разведений в 95% случаев, стандартное отклонение должно быть ≤0,250 (рисунок 8C).

На Рисунке 8 нормальное распределение и стандартное отклонение.  На рисунке (A) показано нормальное распределение результатов анализа. Если эффективность ПЦР составляет 100%, то есть одно значение C_T, которое находится в пределах средних значений двукратного разведения (образцы X и Y). Для того, чтобы точно определить значение C_T для обоих образцов в 99,7% случаев, стандартное отклонение должно быть 1 C_T, деленное на 6 стандартных отклонений (1/6=0.167), как показано на рисунке (B). Для того, чтобы точно определить значение C_T для обоих образцов в 95% случаев, стандартное отклонение должно быть 1 C_T, деленное на 4 стандартных отклонений (1/4=0.25), как показано на рисунке (C).

Чувствительность

Любая из современных систем ПЦР в реальном времени достигла такого уровня чувствительности, что стало возможно детектировать единичную копию ДНК-матрицы в образце. Чувствительность не зависит от абсолютного значения C_T.

Как было сказано ранее, ключевым фактором для расчета чувствительности метода является эффективность реакции (рисунок 5). Другим важным моментом, связанным с детекцией малого количества копий ДНК является то, что распределение ДНК-матрицы будет отличаться от нормального. Вместо этого, оно будет стремиться к распределению Пуассона: то есть, если мы имеем большую выборку повторений, в каждом из которых, в среднем, по одной копии ДНК-матрицы, то, согласно распределению, в 37% образцов не будет ни одной копии, 37% будут иметь одну копию, а 18%  – по две копии ДНК-матрицы (см. рисунок 9). Следовательно, для того, чтобы обеспечить достаточную достоверность детекции малого количества ДНК, необходимо проводить достаточное количество повторений, для того, чтобы обойти ограничения, связанные с распределением Пуассона.

Вывод

Вышеописанные факторы: эффективность реакции, R², точность и чувствительность метода необходимо учитывать при сравнении результатов ПЦР анализа при различающихся условиях реакции. Для более точных результатов сравнения, все факторы, указанные в табл. 1 должны быть учтены вместе.

Вместе с тем, дополнительные виды контроля, такие как NTC (отрицательный контроль), no RT-контроль (контроль без обратной транскрипции) и контроль качества ДНК должны быть проведены для каждого анализа.

Попробуем применить полученные знания на примере.

В фермерском хозяйстве выявили нескольких животных с симптомами африканской чумы. Как известно, заболевание это очень «коварно»: оно может проходить как и остро, так и бессимптомно. Из-за этого болезнь распространяется крайне непредсказуемо, что чревато потерей всего поголовья свиней.

Африканская чума свиней – это вирусное заболевание. Особенностью любых вирусных заболеваний является то, что в организме хозяина вирус представлен не только в виде отдельных возбудителей-вирионов, но также и в виде молекул вирусной ДНК.

Все классические методы диагностики – патологоанатомические, иммунологические и т.п. являются косвенными, и иногда невозможно своевременно выявить носителей вируса в во время инкубационного периода или бессимптомного течения болезни. В таком случае, ПЦР-диагностика является наиболее точным, чувствительными и высокоспецифичным методом диагностики. Кроме того, благодаря особенностям Real-time PCR возможно определить количественное содержание вируса у отдельно взятого животного.

Для проведения ПЦР-исследования необходимо отобрать биологический материал – это может быть как и кровь, так и ткани внутренних органов. Далее, проводят выделение и очистку ДНК.

Подготовка образцов

Выделение ДНК в общем случае проводят путем разрушения (лизиса) клеток, содержащихся в образце (тем самым, высвобождая в том числе и вирусную ДНК) и очистке полученного лизата от белков, жиров и углеводов. Обеспечивается это обработкой образца поверхностно-активными веществами (например, SDS) или хаотропными агентами (напр. гуанидилтиоцианатом) в присутствии протеиназ. Далее, ДНК пререносят на носитель: к лизату добавляют суспензию ионообемнных шариков, или же его пропускают через ионообменную мембрану, на которые специфически «налипают» молекулы ДНК. Носитель с прикрепленными к нему молекулами ДНК отмывают от клеточного дебриса, после чего элюируют («открепляют») ДНК, с помощью растворителя с низкой ионной силой, чаще всего MQ-водой. На выходе получается высокоочищенный раствор ДНК, пригодный для проведения анализа.

Амплификация

На этапе ПЦР необходимо подобрать специфическую для данного возбудителя пару праймеров – они должны обеспечить амплификацию уникального для данного вируса гена/локуса. В случае, если проводят Real-time PCR, возможно определить количество ДНК вируса в образце. Однако, для того, чтобы оценка количества ДНК вируса была достоверна, необходимо соблюсти ряд условий:

Для анализа необходимо отобрать одинаковый тип и количество биоматериала у всех больных или «подозрительных» животных;

• Забор материала должен быть произведен в одно и то же время;
• Выделение ДНК из образцов должно производиться одновременно и одним и тем же методом (набором реактивов);
• ПЦР для всех образцов необходимо проводить в одинаковых реакционных смесях, на одном и том же приборе;
• Если все образцы невозможно проанализировать за один прогон, протокол анализа на приборе должен быть одним и тем же для всех образцов.

Только при соблюдении всех условий возможно получить достоверные данные.

Если же важно установить только факт наличия возбудителя заболевания у животного, данные условия не обязательны.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Кривая амплификации
Кривая амплификации показывает зависимость флуоресценции репортерного красителя от номера цикла. Реакции различаются по времени, когда возможно обнаружить продукты амплификации. Чем больше изначальное количество ДНК-матриц в исследуемом образце, тем раньше возникнет достаточная для детекции флуоресценция.

Базовая линия
Во время начальных циклов реакции наблюдаются фоновые флуоресцентные сигналы. В соответствие с этим фоном необходимо настроить значение базовой линии.

Дельта Rn
Значение ΔRn представляет собой разницу значений Rn и базовой линии.

Референтный краситель
Краситель, который создает внутреннюю референтную флуоресценцию, по отношению к которой можно нормализировать репортерную флуоресценцию. Нормализация необходима для того, чтобы скорректировать флуктуации, связанные с различиями концентраций компонентов реакционной смеси, объема и особенностей образца.

Эффективность ПЦР
Следующая формула описываю прохождение ПЦР:
Cn=Ci*(1+E)n , где
Ci – начальное количество ДНК-матрицы,
Cn – количество ампликонов на цикле n,
n – количество циклов,
E – эффективность данной реакции.
Если эффективность максимальная (=1), тогда формула приобретет вид Cn=Ci*2n, при этом количество продуктов реакции (ампликонов) будет увеличиваться в 2 раза с каждым циклом. Если эффективность ниже, то каждый цикл ампликоны будут синтезироваться в меньшем количестве, что отобразиться на кривой амплификации. Оптимальная эффективность – от 90 до 110%.

Репортерный краситель
Репортерный краситель связан с 5’-концом зонда TaqMan®. При гибридизации зонда с ДНК-матрицей, этот краситель дает флуоресцентный сигнал, сигнализирующий об успешной гибридизации. Если используется краситель SYBR® Green , то сигнал последует при интеркалляции красителя в двухцепочечеую ДНК, что свидетельствует об успешной амплификации. Специфичность связывания с целевой последовательностью ДНК необходимо проверить по кривой плавления продуктов реакции, либо на гель-электрофорезе.

Rn
Значение Rn представляет собой отношение интенсивности флуоресценции репортерного красителя к интенсивности флуоресценции референтного красителя.

Пороговое значение (пороговая линия, порог чувствительности)
Это значение ΔRn для CT в данном виде анализа. Порог чувствительности настраивается таким образом, чтобы он был выше базовой линии, но при этом кривая амплификации должна пересекать его в самом начале экспоненциальной фазы.

Пороговый цикл (CT)
Цикл, во время которого кривая амплификации пересекает пороговое значение.

Полимеразно-цепная реакция, пожалуй, один из самых чувствительных и наиболее точных методов диагностики различных инфекционных заболеваний, особенно, передающихся половым путем. Определяя даже незначительное количество частиц ДНК бактерий, вирусов, грибов, ПЦР является и достаточно специфичным методом, редко дающим ложноположительные результаты.

Ложноположительный результат означает, что на самом деле инфекции нет, а реакция положительная.

Но, даже имея 98-99% точности, при ПЦР иногда также бывают неверные ответы, которые практически никогда не связаны с самой реакцией, а больше с нарушениями на предварительном этапе.

Причины ложноположительного результата анализа ПЦР:

• Не выдержаны сроки для проведения контрольных анализов после лечения половых инфекций. Дело в том, что большинство инфекций находятся внутри клеток или фиксированы на поверхности их мембран. Во время полноценного лечения возбудитель ИППП погибает, но частицы его генома (ДНК) остаются еще некоторое время в организме хозяина. Нужно время, порядка 3 недель, чтобы эти клетки заменились на новые, не контактировавшие с инфекционным агентом, тогда и берется контроль. Если же взять анализ раньше, то, благодаря своей высокой чувствительности, ПЦР определит ДНК уже погибших бактерий и укажет на наличие возбудителя, что будет являться ложноположительным, так как инфекция уже погибла.
  Наши врачи обладают достаточными знаниями в области диагностики ЗППП и выдерживания сроков, поэтому такие ситуации в клинике Частная практика исключены.
• Попадание ДНК инфекций, передающихся половым путем, в пробирку с рук венеролога, с перчаток и урологических зондов.
  Данный фактор исключен, так как для забора материала используются только одноразовые перчатки, пробирки и зонды.
• Крайне редко встречаются ложноположительные результаты при наличии в соскобе близкородственных микроорганизмом. То есть анализатор выдает наличие патогенной бактерии, вызывающей венерическое заболевание, а на самом деле это компонент нормальной микрофлоры. Но эта проблема уже давно решена внедрением более современных и специфических тест-систем.
• Контаминация или занесение ДНК инфекций в пробирку на лабораторном этапе исследования тоже был когда то возможен, но практически исключен правильной организацией процесса диагностики и обучением персонала.

В любом случае диагноз ставится всегда не только на основании результатов одного анализа. Окончательный диагноз заболевания, передающегося половым путем, это совокупность жалоб, клинического осмотра и комбинации различных лабораторных и инструментальных методов.

Если у уролога, гинеколога или венеролога появляются сомнения в правильности полученных результатов ПЦР или выявляется несоответствие имеющейся клинической картины и данных лабораторной диагностики между собой, то врач всегда порекомендует дообследование с применением методов ИФА, НАСБА, посевов, с целью уточнения ситуации.

В наших клиниках есть все доступные современной медицине методики обследования мужчин и женщин. Поэтому установление ложных диагнозов ИППП исключено.

Врач клиники «Частная практика» дерматовенеролог, уролог Волохов Е.А. рассказывает об анализе ПЦР на инфекции.

Вернуться в главный раздел

Алексей Жигулин, ООО «Силекс», info@sileks.com
21 марта 2021 года

Часто рассмотрение эволюции какого-либо метода позволяет увидеть его будущее через логику развития событий.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР, Polymerase Chain Reaction, PCR) — это великолепный пример такого метода. ПЦР является широко распространенным методом, используемым для диагностических целей и исследований в области молекулярной биологии. В основе ПЦР лежит принцип многократного увеличения (амплификации) определенного участка нуклеиновой кислоты (НК) ферментом ДНК-полимеразой.
Как только была открыта ДНК и сложилось представление о ее роли и структуре, активность исследований в этой области росла как снежный ком. Можно считать, что история нашего метода берет начало от легендарных ученых Артура Корнберга (Arthur Kornberg) и Чарльза Ричардсона (Charles C. Richardson) и их статей, посвященным ДНК полимеразам [1,2].
Другой интересной работой, которая немного опередила свое время и поэтому не вызвала переворот в развитии метода, была статья Хьелля Клеппе [3]. Его работа была направлена на разработку методов синтеза высокомолекулярной биспиральной (по выражению автора) ДНК со специфическими нуклеотидными последовательностями.
Тот метод ПЦР, который мы знаем сегодня, разрабатывался биохимиком Кэри Муллисом (Kary Mullis) с соавторами. Статью Kary Mullis “Unusual origin of the Polymerase Chain Reaction” [4] можно читать как научный роман, написанный от первого лица. Всем настоятельно рекомендую прочитать эту потрясающую статью. Универсальность ПЦР заключается в том, что она амплифицирует небольшие количества последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, давая количество продукта, которое может быть обнаружено последующими методами, такими как визуализация НК на агарозном геле. Это связано с экспоненциальной наработкой последовательности и получением миллионов копий исходного шаблона.
Стремительное развитие ПЦР можно проследить по самым первым статьям [5,6,7].

Компоненты ПЦР

Чтобы ПЦР мог работать, реакционная смесь должна содержать следующие компоненты:

• матрицу;
• праймеры;
• нуклеотиды (трифосфаты);
• ДНК полимераза;
• буфер.

Матрица
Матрицей для ПЦР может выступать любая нуклеиновая кислота – ДНК, РНК, кДНК. Чтобы быть эффективной матрицей, участок, представляющий интерес для работы, не должен иметь сложные структурные образования (шпильки), быть жестко связанным с каким-либо протеиновым комплексом или иной химической структурой.

Праймеры
Праймеры не должны быть комплиментарными друг к другу, чтобы не образовывать праймер-димеров. Праймеры должны иметь длину, по возможности минимальную, чтобы можно было максимально комфортно оптимизировать температуру отжига. И самое главное – праймеры должны быть высокоспецифичными, т.е., отжигаться исключительно на требуемой последовательности. Именно это условие и является основной проблемой ПЦР.

Нуклеотиды (трифосфаты)
Основное требование к трифосфатам — не содержать ди-, монофосфаты.

ДНК полимераза
На сегодняшний день существует огромное количество вариаций ДНК полимераз, как термостабильных (наиболее часто используемых в рутинном ПЦР), так и термолабильных, применяемых в изотермических ПЦР. Почти всегда коммерческие ДНК полимеразы имеют собственные уникальные названия, которые мало или совсем никак не отражают их реальные свойства. Поэтому выбор оптимальной полимеразы – дело опыта и эмпирического подбора под конкретную задачу.

Буфер
Буфер должен содержать компоненты, необходимые для эффективной полимеразной реакции. Чаще всего такими компонентами являются:

• соли, обеспечивающие поддержания определенного значения рН (часто это разные модификации Tris);
• соли, обеспечивающие ионную силу (в основном это соли калия, натрия, аммонийные соли);
• кофактор полимеразы (хлорид или сульфат магния);
• различные компоненты, влияющие на стабильность полимеразы, матрицы, праймеров (ионные и неионные детергенты, спирты и т.д.).

Принцип ПЦР

Принцип работы ПЦР состоит из трех базовых этапов:

1. денатурация;
2. отжиг праймера;
3. элонгация.

Эти этапы повторяются N-ное количество раз (циклов), обычно от 20 до 50 циклов, в результате чего и происходит многократная наработка конечного продукта. Количество циклов определяется конкретными задачами и условиями ПЦР.

Денатурация
Денатурация (Denaturation) – это этап, на котором происходит разделение цепей матрицы и отделение ново синтезированной цепи от цепи матрицы. Денатурация может быть термической («классический» ПЦР) и ферментативной (изотермический ПЦР).

Отжиг праймера
Отжиг праймера (Annealing) – это ситуация, при которой праймер (нуклеотидный зонд) соединяется с комплементарным участком матрицы. Условия отжига могут определяться температурными режимами или контролироваться ферментативно.

Элонгация
Элонгания (Extention) – этап, на котором фермент ДНК полимераза выполняет свою непосредственную работу – достраивает комплементарную цепь, используя матрицу и отожженный на ней праймер.

Рисунок 1. Схематическое изображение полного цикла ПЦР (взято из статьи https://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction)

Типы ПЦР

Все существующие на сегодняшний день типы ПЦР можно свести в таблицу, приводимую ниже. Используется ли в ПЦР тепловой принцип денатурации, ферментативный или какой-либо другой, не вносит в приводимую классификацию никаких принципиальных изменений.
Перечисление типов ПЦР сверху вниз отражает их историческое развитие.

Цифровой капельный ПЦР можно считать верхней ступенью развития

Рисунок 2. Возможности цифрового ПЦР

Типичные проблемы ПЦР

Несмотря на большие возможности, который дает ПЦР, исследователи регулярно сталкиваются с одними и теми же проблемами, которые приводят к ошибкам и неверной интерпретации получаемых результатов.
Очень важно научиться понимать, что может быть источником ошибок, вовремя их избегать и уметь предвидеть источник их происхождения.

Рисунок 3. Как наука учится признавать ошибки (How Science Is Learning to Admit Mistakes, https://www.freethink.com/articles/admitting-mistakes)

Оборудование
Оборудование включает в себя приборы (амплификатор, другое оборудование для проведения ПЦР, электрофорез и т.п.), пластик (наконечники, пробирки), пипетки.
Каждый амплификатор (или другое оборудование для проведения ПЦР) имеет свой алгоритм работы, к которому нужно приноровиться (правильно выбрать температурные и временные режимы). Если требуется анализ в геле, нужно быть уверенным, что продукт в геле будет надлежащим образом прокрашен и визуализирован с необходимой чувствительностью. Часто, при многократном использовании камер для электрофореза, в них может накапливаться компоненты, которые могут приводить к деградации продуктов ПЦР в процессе электрофореза.
Для разных амплификаторов могут потребоваться пробирки определенного качества, которые придется подбирать для конкретного прибора. Часто качество пластика, из которого изготовлены пробирки и наконечники, влияют на стабильность нуклеиновой кислоты и ампликонов. Поэтому при выборе пластика требуется особенно тщательно обращать внимание на качество. Пипетки также могут быть источниками внешних загрязнений (нежелательных ампликонов, компонентов, которые могут оказывать влияние на стабильность нуклеиновых кислот и ампликонов).

Праймеры и реактивы
Праймеры и внутренние зонды – самый распространенный источник проблем в ПЦР. Проблемы связанные с праймерами имеют несколько причин:

• неудачный выбор праймера, приводящий к неспецифическому отжигу и другие проблемы, связанные с дизайном праймера;
• нестабильность (деградация) праймера в процессе его использования.

Ферменты, буфера, трифосфаты и другие компоненты в меньшей степени служат источником проблем и вызываемые ими проблемы легко выявляемы. Но и здесь нужно учитывать особенности используемых ферментов и буферов, в которых они работают.

Ошибки планирования и интерпретации получаемых результатов
Самыми трудно выявляемыми являются ошибки, связанные с планированием ПЦР и последующей интерпретацией получаемых результатов.
Одна из самых главных ошибок – недооценка качества материала, полученного выделением из исходного анализируемого образца. Выделение разными методами и наборами дает материал, содержащий разного рода примеси, специфические для данного метода или набора. Выбор оптимального способа подготовки материала – первый шаг к получению корректного результата.
Другая частая ошибка – неправильное использование контроля. Контроль может быть внутренним (та же нуклеиновая кислота, которая используется для анализа, но другая последовательность) или внешним (дополнительно вносимый в образец, так называемый spiked, spike-in, spike контроль). Проблемы с внутренним контролем в мультиплексном ПЦР связаны с тем, что иногда эффективность амплификации контрольного участка оказывается более высокой по сравнению с анализируемым участком. Реактивы расходуются на амплификацию контроля и в результате получаются заниженные значения целевой амплификации.
Проблемы с вносимым внешним контролем более сложные.
Внешние контроли часто вносят в исходный образец перед выделением. Нуклеиновые кислоты, в особенности ампликоны, вносимые в такие биологические образцы как плазма, сыворотка, слюна, моча, подвергаются активному воздействию многочисленных разрушающих компонентов. В результате вносимый контроль разрушается, иногда в считанные секунды, и оценить качество выделения при последующем анализе посредством ПЦР не представляется возможным. Даже если вносимый образец не подвергся разрушению на стадии внесения перед выделением, внешняя нуклеиновая кислота может влиять на результат амплификации в процессе ПЦР и приводить к ложно позитивным результатам.

Заключение

Оглядываясь назад на путь, который проделал метод ПЦР, можно сказать, что это был путь, который привел к новым возможностям для фундаментальных исследований, трансляционных исследований и клинической диагностики. Простота использования и постоянные модификации метода на протяжении многих лет вывели довольно простую химическую реакцию на передний план в научных фундаментальных исследованиях и диагностической медицине.

Литература

• Kornberg, A., Science 28 Mar 1969: Vol. 163, Issue 3874, pp. 1410-1418
• Richardson, C C (1969). Enzymes in DNA Metabolism. Annual Review of Biochemistry, 38(1), 795–840.
• Kleppe, K.; Ohtsuka, E.; Kleppe, R.; Molineux, I.; Khorana, H.G. (1971). Studies on polynucleotides. Journal of Molecular Biology, 56(2), 341–361.
• Mullis KB. The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American. 1990; 262(4): 56–61. 64–5.
• Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1986;51 Pt 1:263-73
• Mullis K, Faloona F. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 1987;155:335-50
• Saiki R, Scharf S, Faloona F, Mullis K, Horn G, Erlich H, et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomicsequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 1985;230:1350-4

Вернуться в главный раздел