Ошибки при проведении пцр

Команда «Биокор Текнолоджи» разрабатывает тест-системы и наборы для молекулярной диагностики методом ПЦР, и расскажет в этом материале, на какие детали стоит обратить внимание для предотвращения ложноположительных и ложноотрицательных результатов.

ПЦР является универсальным методом лабораторной диагностики, позволяющим идентифицировать даже не собственно вирус или бактерию в биологическом материале, а участки их РНК или ДНК.

Чувствительность ПЦР-анализа приближается к 10-100 копиям генетического материала возбудителя на реакцию. Для сравнения, если человек находится в активной фазе развития заболевания, то его биологический материал содержит миллионы геномов возбудителя на миллилитр, что, после выделения нуклеиновой кислоты будет равно нескольким тысячам копий на реакцию.

В мире, и в Украине в частности, с начала эпидемии COVID-19 ведутся дискуссии относительно того, насколько надежной является такая методика. Одни источники говорят, что ошибочным может быть каждый четвертый тест, другие указывают, что количество ложноположительных и ложноотрицательных результатов составляет лишь несколько процентов. Учитывая актуальность темы, рассмотрим на примере ПЦР для диагностики COVID-19 по каким причинам могут возникать сомнительные или ошибочные результаты. Большинство указанных аспектов имеет место и в случае с ПЦР-тестированием других инфекционных заболеваний человека.

Особенности выбора места для взятия биологического материала

Такие возбудители, как SARS-CoV-2, способны поражать значительное количество органов. Для исследования на COVID-19 обычно берутся мазки из горла или носоглотки, где возбудитель в большом количестве находится ограниченное время — на 5-10 день от начала инфицирования, далее он спускается ниже — к бронхам и легким. Поэтому отрицательный результат ПЦР-теста не может исключать факта инфицирования пациента COVID-19.

С одной стороны, риски получить ложноотрицательный результат ПЦР-теста несколько возрастают на 1-7 день от начала инфицирования, когда количество вируса мало, а также на 10-30 день, когда, во-первых, COVID-19 уже «ушел» ниже, и, во-вторых, в организме уже присутствуют в достаточном количестве антитела, и размножение вируса более или менее эффективно сдерживается иммунной системой. С другой стороны, в некоторых случаях, мы можем получить сомнительно положительный результат ПЦР-теста даже на 60-й день от начала инфицирования, когда человек уже переболел, но в ее биологическом материале все еще можно найти обломки вируса. Все вышесказанное касается только некоторых отдельных случаев и не имеет характера «абсолютной закономерности».

Алгоритм тестирования регламентирован на государственном уровне и, если существует обоснованное подозрение на инфицирование COVID-19, для уточнения диагноза могут проводить ПЦР-анализ повторно.

Неправильное взятие биологического материала

Во избежание ложноположительных результатов вследствие загрязнения — попадание молекул ДНК/РНК из внешней среды, — клинический материал необходимо отбирать стерильными одноразовыми инструментами в одноразовые стерильные пробирки согласно установленным стандартам МОЗ. Взятие материала должны проводить медицинские работники, одетые в средства индивидуальной защиты.

Недостаточное количество биологического материала может привести к ложноотрицательным результатам исследования. В некоторых случаях, эту проблему можно отследить на этапе выделения нуклеиновых кислот или в процессе амплификации (при условии использованием в диагностических наборах для обнаружения SARS-CoV-2 внутреннего контроля, то есть фрагмента генома человека).

Несоблюдение температуры и сроков хранения

Учитывая возможность распада РНК в клиническом материале, сроки хранения и транспортировки должны быть минимальными. В идеальном случае все мазки нужно транспортировать в лабораторию в течение 24-48 часов с момента взятия в специальном транспортной среде при температуре плюс 4 °C. Транспортная среда должна содержать специальные реагенты — муколитики, обеспечивающие разрушение слизи, которая подавляет ПЦР. Если отсутствует возможность своевременно доставить образцы материалов в лабораторию, их можно замораживать до минус 70 °C, используя для этого твердую углекислоту — «сухой лед». Образцы можно хранить в лаборатории в течение недели при температуре минус 20 °C, или до месяца при температуре минус 70 °C. Критическим моментом является количество замораживаний/размораживаний образца: чем их больше, тем ниже качество образца и, вследствие этого, и чувствительность метода в целом.

В результате нахождения образцов в транспортной среде больше срока, рекомендованного производителем, происходит рост естественной бактериальной микрофлоры, которая обычно находится в ротовой полости человека, и разрушение молекул вирусной РНК в образце. При использовании специальных консервантов и стабилизаторов, биоматериал может храниться в температурном диапазоне в соответствии с инструкцией производителя сроком до месяца.

Выделение нуклеиновых кислот

ПЦР-исследование не проводится непосредственно на биологических образцах и требует предварительной пробоподготовки. На этом этапе большое значение имеет качество наборов для экстракции нуклеиновых кислот, которые должны обеспечить выделение образца соответствующей концентрации и степени очистки от примесей, подавляющие ПЦР. Из-за неправильного выбора набора также может быть потеряна часть или даже все РНК возбудителя, что может приводить к ложноотрицательным результатам. Качество и чистоту нуклеиновых кислот можно проверить с помощью специального аналитического прибора — спектрофотометра. Он есть во многих лабораториях, осуществляющих ПЦР-исследования.

Выделенную из образцов РНК можно хранить при температуре минус 20 °C до недели. Для более длительного хранения нужна температура минус 70 °C. Также можно использовать специальные реагенты, стабилизирующие РНК и предупреждают ее деградации (например, DEPC — диэтилпирокарбонат).

Амплификация

Процесс амплификации (увеличение копий участков ДНК, которые обычно содержат необходимые фрагменты целевых генов) может включать до 45 циклов, во время каждого из них количество копий удваивается. Он обеспечивается реагентами, которые входят в диагностические наборы для выявления SARS-CoV-2, и приборами, обеспечивающими циклическую смену температур — амплификаторами.

Для обеспечения корректных результатов, качество диагностических наборов является первоочередным требованием. Также лаборатории должны проводить процедуру их верификации, проведя сравнительные испытания с собственными панелями референтных образцов и решениями от других производителей. Наборы должны поступать в лаборатории в термобоксах с холодовыми блоками и храниться при температуре минус 20 °C. Несоблюдение условий их транспортировки или хранения приводит к повреждению компонентов наборов, и, вследствие того, к ложноотрицательным результатам. Чтобы предупредить эту ошибку, в состав каждого диагностического набора входит положительный контрольный образец, задачей которого является установление работоспособности реагентов.

Диагностические наборы должны быть совместимыми с амплификаторами, используемыми в лаборатории. Реагенты, входящие в состав набора, меченные различными флуоресцентными красителями. Детекция флуоресцентного сигнала от каждого красителя происходит в определенном диапазоне (на определенном «канале»). Если прибор имеет слабую чувствительность по определенным флуоресцентным каналам, это может приводить к ошибочным результатам. Во избежание ошибок работники лабораторий должны проверять исправность работы приборов, а также настройки параметров работы и протоколов амплификации.

Контаминация образцов

При несоблюдении мер безопасности в помещениях лаборатории могут накапливаться продукты амплификации. Это приводит к контаминации образцов, и, в общем итоге, к ложноположительным результатам. Для подтверждения отсутствия загрязнения, каждую серию ПЦР-исследований нужно сопровождать постановкой негативных контрольных образцов, включенных в состав диагностических наборов для выявления SARS-CoV-2.

Перекрестная контаминация может возникать из-за попадания аэрозольных частиц от соседнего образца, содержащего вирусную РНК, при внесении образцов в ПЦР-смесь. На этапе амплификации контаминированный образец издает слабый положительный результат, который означает, что в исследуемой пробе обнаружено очень малое количество вируса. Но такой результат также может указывать, что человека тестировали до наступления полного выздоровления и уровень вируса в его организме был низким.

Способы предупреждения контаминации — использование наконечников с фильтрами, химическая и ультрафиолетовая дезинфекция всех рабочих поверхностей, наличие отдельных наборов дозаторов, оборудования, халатов и перчаток для каждой зоны, проведения внутрилабораторного и внешнего контроля качества исследований — регламентированы на государственном уровне.

Другими эффективными, однако дорогостоящими мероприятиями для предотвращения контаминации является автоматизация этапов выделения нуклеиновых кислот и амплификации, а также двойной контроль — постановка каждого образца в двух параллельных реакциях.

Ошибки обработки данных

Расчеты результатов ПЦР в реальном времени проводятся с использованием компьютерных программ. Амплификатор в автоматическом режиме измеряет интенсивность флуоресценции в образцах на каждом цикле. Кривая амплификации имеет так называемую фазу экспоненциального роста, после которой следует фаза плато. Автоматическая интерпретация результатов не всегда дает правильный результат, поэтому рекомендуется проводить анализ кривых амплификации на предмет пересечения пороговых значений, и корректировать задачи пороговых значений по мере необходимости. Для большей достоверности можно сравнить такую ​​сомнительную кривую с кривой подтвержденного положительного образца.

Подытожим

На каждом этапе исследования являются условия, несоблюдение которых может привести к недостоверным результатам. Некоторые из потенциальных ошибок являются общими для большинства видов лабораторной диагностики (например, ошибки при взятии и хранения образца, настройка оборудования), тогда как другие являются специфическими только для этого вида исследования (например, контаминация образцов, низкое качество выделенных нуклеиновых кислот).

ПЦР — многостадийный метод, и для получения максимально достоверных и воспроизводимых результатов необходимо надлежащее выполнение каждого этапа процесса в соответствии со стандартами МОЗ и инструкциями производителей. Вторым важным условием является качество всех реагентов и расходных материалов, используемых в ПЦР: систем для сбора биологических материалов, наборов для выделения нуклеиновых кислот, диагностических наборов для выявления SARS-CoV-2.

Real-Time PCR: Как избежать ошибок

Ключевые факторы, оценка значения C_T, применение на практике

ПЦР в реальном времени (также известна как количественная ПЦР, real-time PCR, или qPCR) является простой и эффективной методикой количественного определения целевой последовательности ДНК в образцах. Зачастую, по причине крайней простоты освоения и выполнения данной методики, некоторые факторы, оказывающие критическое влияние на успешность метода, остаются без внимания. В этом обзоре мы рассмотрим ключевые факторы, которые необходимо учитывать при подготовке и интерпретации результатов real-time PCR.

Факторы, влияющие на C_T

C_T-величина (англ. Threshold cycle – пороговый цикл) – это значение количества циклов реакции, при котором кривая амплификации и прямая порога чувствительности прибора пересекаются (рис. 1B). Это значение является относительным показателем содержания ДНК-матрицы в образце, так как различия в количестве молекул матрицы в начале реакции влияют на количество циклов, необходимых для поднятия уровня флуоресценции выше уровня шума. Кроме того, на абсолютное значение C_T влияет множество других факторов, которые не зависят от изначального количества ДНК-матрицы в реакции. В данной статье мы обсудим самые часто встречаемые факторы, влияющие на значение C_T и выясним, как правильно оценивать эффективность прохождения real-time PCR.

На рисунке 1 изображены некоторые параметры кривой амплификации. Экспоненциальная фаза на рисунке 1B соответствует линейной фазе кривой на рисунке 1C. На рисунке 1C пороговое значение должно пересекать линейный участок кривой амплификации. Значение C_T обратно пропорционально количеству ДНК-матрицы в реакции, то есть чем меньшее количество ДНК-матрицы находится в реакционной смеси, тем большее количество циклов необходимо для достижения порогового количества продукта амплификации. Однако любые изменения в составе реакционной смеси или настройках детектора флуоресценции могут оказывать влияние на значение C_T. Соответственно, значение C_T для реакций, которые были проведены при разных условиях или в которых были использованы разные реактивы, не могут быть непосредственно сравнены друг с другом.

Рисунок 1:  A: Значение Rn представляет собой отношение интенсивности флуоресценции репортерного красителя к интенсивности флуоресценции референтного красителя. Другими словами, Rn – это репортерный сигнал, нормализованный к сигналу ROXÔ. На этом рисунке ось X отображает номер цикла ПЦР, ось Y – значение Rn.

B: Значение ΔRn представляет собой разницу значений Rn и базовой линии. На этом рисунке ось X отображает номер цикла ПЦР, ось Y – значение ΔRn.

C: График кривой амплификации представлен в виде логарифмической функции Log(ΔRn) от номера цикла.

Влияние компонентов реакционной смеси

Интенсивность флуоресценции каждой молекулы зависит от внешних факторов, к ним относятся, например, pH или концентрации солей в реакционной смеси. На рисунке 2 изображён график флуоресценции зонда TaqMan® в двух различных реакционных смесях. Обратите внимание, что интенсивность флуоресценции в реакционной смеси A выше, несмотря на одинаковую концентрацию ДНК-матрицы, зонда и красителя ROX™ в обеих смесях.

Рисунок 2: Пики флуоресценции, полученные при анализе двух разных реакционных смесей с одинаковым количеством ROX™. Различия в значении сигналов обусловлено составом реакционных смесей. На этом рисунке ось X отображает длину волны флуоресценции, ось Y – интенсивность свечения флуорофора.

В результате, значение ΔRn будет различным, это отображено на рисунке 3. Обратите внимание, что базовые линии для двух реакционных смесей различны (рисунок 3А). Различие в значении C_T не отображает общую производительность реакционной системы (рисунок 3B). Реакционные смеси с эквивалентными показателями чувствительности могут иметь различные абсолютные значения C_T.

На рисунке 3 в реакционных смесях A и B была проведена амплификация гена РНКазы P человека. В обеих образцах было использовано одинаковое количество геномной ДНК. На рисунке 3A показана зависимость Rn от номера цикла и базовые линии для обеих реакций. На рисунке 3B показана зависимость значения Log (ΔRn) от номера цикла. Значение порога чувствительности (зеленая прямая) одинаково для обеих реакций. Пороговый цикл C_T для реакционной смеси B (C_TB) наступает раньше, чем для реакционной смеси A (C_TA) при одинаковом количестве ДНК-матрицы в обеих образцах.

Пассивный референтный краситель ROX™

Величина Rn представляет собой отношение интенсивности флуоресценции красителя FAMÔ к  флуоресценции красителя ROX. Таким образом, если концентрация красителя ROX будет меньше, а концентрация FAM останется неизменной, величина Rn будет выше. Это приведет к тому, что значение базовой линии станет выше, и вследствие этого, ΔRn будет меньше, что в конечном итоге приведет к другому значению C_T. Различие в значениях C_T при уменьшенных концентрациях ROX не является показателем увеличения чувствительности реакции, при этом могут появиться другие нежелательные последствия. Низкая концентрация ROX в реакционной смеси может привести к увеличению стандартного отклонения значения C_T, как показано на рисунке 4. Чем больше стандартное отклонение, тем менее достоверны данные, особенно если есть необходимость детектировать небольшие различия концентрации целевой последовательности ДНК. (Более подробно это описано в разделе Точность).

На Рисунке 4. В трех реакционных смесях с различным содержанием ROX™ была проведена амплификация Трансформирующего ростового фактора бета (TGF beta). На рисунке 4A изображено значение C_T, на рисунке 4B изображено стандартное (среднеквадратическое) отклонение. Чем меньше концентрация ROX, тем раньше наступает пороговый цикл, но это увеличивает стандартное отклонение.

Эффективность ПЦР

Степень эффективности полимеразной цепной реакции тоже влияет на величину C_T. Сравнивая серии разведений, амплифицированых в условиях низкой и высокой эффективности реакции, мы обнаружим, что кривые амплификации имеют разный угол наклона. На рисунке 5, два образца (X и Y), амплифицированые в условиях низкой и высокой эффективности реакции, показывают различные значения C_T при одной и той же концентрации ДНК-матрицы. В этом примере, кривая амплификации при высокой эффективности реакции (синий график на рисунке 5) дает более низкое значение C_T при высокой концентрации ДНК-матрицы, хотя она имеет более высокую чувствительность при низкой концентрации ДНК-матрицы.

Рис. 5. Синяя стандартная кривая отображает 100% эффективность реакции (наклон -3,3). Зеленая стандартная кривая отображает 78% эффективность реакции (наклон -4). При амплификации Y молекул ДНК-матрицы в условиях низкой эффективности реакции пороговый цикл наступает раньше, чем в условиях высокой эффективности реакции. При меньшем количестве молекул ДНК-матрицы происходит наоборот – при низкой эффективности реакции пороговый цикл наступает позже, чем в условиях высокой эффективности реакции.

Эффективность ПЦР зависит от типа анализа, качества реакционной смеси и качества ДНК в образце. Как правило, эффективность реакции 90-110% считается приемлемой.

Различие в значении C_T для двух образцов может достоверно свидетельствовать о различной концентрации ДНК-матрицы в этих образцах только при условии одинаковых настройках оборудования, реактивов и типа анализа. Однако, если анализ был проведен на разном оборудовании, были использованы разные реактивы, праймеры или зонды, либо реакции проводились в разных объемах – различия в значениях C_T не дадут нам достоверной информации. Следовательно, абсолютные значения C_T имеет смысл сравнивать только в том случае, если все условия реакции были абсолютно одинаковыми.

Как оценить эффективность ПЦР в реальном времени

В случае, если какие-либо условия эксперимента были изменены (например, анализ проводился на разном оборудовании или в разных реакционных смесях), необходимо учитывать следующие параметры.

Динамический диапазон

 Для того, чтобы точно оценить эффективность реакции, необходимо провести, как минимум, 3 повторения реакции при концентрации ДНК-матрицы 5 log (10⁵ копий ДНК-матрицы на образец). Причина такой необходимости проиллюстрирована на рисунке 6. На нем отображено изменение угла наклона графика зависимости величины C_T при различных градиентах разведения ДНК-матрицы (1 log и 5 log). То есть, если мы будем проводить тестирование серии разведений при концентрации 1 log, и получим показатель 100% эффективности реакции, в реальности, разброс данного показателя будет находится в диапазоне 70-170%. Делая тот же самый тест при концентрации ДНК-матрицы 5 log, потенциальный разброс будет составлять всего ± 8%. То есть, если мы получили значение, например, 94% эффективности (при концентрации 5 log), то действительная эффективность реакции будет в диапазоне 88-100%. Из этого можно сделать вывод, что определять эффективность реакции необходимо при концентрации ДНК-матрицы 5 log. Уклон графика -3,3 ± 10% свидетельствует о 100%  ± 10% эффективности полимеразной цепной реакции. Более низкие значения эффективности ПЦР свидетельствуют о низкой чувствительности метода при данных условиях.

На Рисунке 6 точный расчет эффективности реакции, сделанный на основе серии разведений ДНК-матрицы. Для двукратного разведения на 5 точках (оранжевый) потенциальный разброс значений выше, чем для десятикратного разведения на 5 точках (синий).

Значение R²

Еще одним параметром, без которого невозможно точно рассчитать эффективность реакции, является коэффициент детерминации (R²). В математической статистике этот параметр показывает, насколько точно мы можем спрогнозировать значение некой величины, зная другую. Если R²=1, тогда можно точно установить корреляцию величины X (количество ДНК-матрицы) к Y (значению C_T) (рисунок 7A). Если R²=0, тогда невозможно определить корреляцию величины X к величине Y (рисунок 7B). Значение R²>0,99, в целом, обеспечивает достаточную точность определения корреляции.

На Рисунке 7 пример расчета R² для двух прямых. A: между x и y нет прямой корреляции. B: между x и y есть прямая корреляция.

Точность

Наиболее используемым способом расчета точности метода является вычисление стандартного отклонения (квадратный корень из вариансы). Если множество результатов имеют небольшой разброс относительно средней величины, тогда стандартное отклонение имеет малое значение, если же разброс велик, то стандартное отклонение больше.

На практике, большая выборка представляет собой распределение, близкое к нормальному. Это следствие центральной предельной теоремы, она гласит, что суммы многих независимых, одинаково распределенных случайных величин стремятся к нормальному распределению как к пределу. На рисунке 8А значения распределены таким образом, что 68% из них находятся в пределах одного стандартного отклонения, 95% – в пределах 2 стандартных отклонений, и 99,7% находится в пределах 3 стандартных отклонений.

Если эффективность ПЦР составляет 100%, то есть одно значение C_T, которое находится в пределах средних значений двукратного разведения (рисунок 8B). Для того чтобы определить количество ДНК-матрицы в диапазоне двукратных разведений в 99,7% случаев, стандартное отклонение должно быть ≤0,167. Чем больше стандартное отклонение, тем меньше вероятность достоверно найти разницу между образцами. Чтобы найти разницу между образцами в диапазоне двукратных разведений в 95% случаев, стандартное отклонение должно быть ≤0,250 (рисунок 8C).

На Рисунке 8 нормальное распределение и стандартное отклонение.  На рисунке (A) показано нормальное распределение результатов анализа. Если эффективность ПЦР составляет 100%, то есть одно значение C_T, которое находится в пределах средних значений двукратного разведения (образцы X и Y). Для того, чтобы точно определить значение C_T для обоих образцов в 99,7% случаев, стандартное отклонение должно быть 1 C_T, деленное на 6 стандартных отклонений (1/6=0.167), как показано на рисунке (B). Для того, чтобы точно определить значение C_T для обоих образцов в 95% случаев, стандартное отклонение должно быть 1 C_T, деленное на 4 стандартных отклонений (1/4=0.25), как показано на рисунке (C).

Чувствительность

Любая из современных систем ПЦР в реальном времени достигла такого уровня чувствительности, что стало возможно детектировать единичную копию ДНК-матрицы в образце. Чувствительность не зависит от абсолютного значения C_T.

Как было сказано ранее, ключевым фактором для расчета чувствительности метода является эффективность реакции (рисунок 5). Другим важным моментом, связанным с детекцией малого количества копий ДНК является то, что распределение ДНК-матрицы будет отличаться от нормального. Вместо этого, оно будет стремиться к распределению Пуассона: то есть, если мы имеем большую выборку повторений, в каждом из которых, в среднем, по одной копии ДНК-матрицы, то, согласно распределению, в 37% образцов не будет ни одной копии, 37% будут иметь одну копию, а 18%  – по две копии ДНК-матрицы (см. рисунок 9). Следовательно, для того, чтобы обеспечить достаточную достоверность детекции малого количества ДНК, необходимо проводить достаточное количество повторений, для того, чтобы обойти ограничения, связанные с распределением Пуассона.

Вывод

Вышеописанные факторы: эффективность реакции, R², точность и чувствительность метода необходимо учитывать при сравнении результатов ПЦР анализа при различающихся условиях реакции. Для более точных результатов сравнения, все факторы, указанные в табл. 1 должны быть учтены вместе.

Вместе с тем, дополнительные виды контроля, такие как NTC (отрицательный контроль), no RT-контроль (контроль без обратной транскрипции) и контроль качества ДНК должны быть проведены для каждого анализа.

Попробуем применить полученные знания на примере.

В фермерском хозяйстве выявили нескольких животных с симптомами африканской чумы. Как известно, заболевание это очень «коварно»: оно может проходить как и остро, так и бессимптомно. Из-за этого болезнь распространяется крайне непредсказуемо, что чревато потерей всего поголовья свиней.

Африканская чума свиней – это вирусное заболевание. Особенностью любых вирусных заболеваний является то, что в организме хозяина вирус представлен не только в виде отдельных возбудителей-вирионов, но также и в виде молекул вирусной ДНК.

Все классические методы диагностики – патологоанатомические, иммунологические и т.п. являются косвенными, и иногда невозможно своевременно выявить носителей вируса в во время инкубационного периода или бессимптомного течения болезни. В таком случае, ПЦР-диагностика является наиболее точным, чувствительными и высокоспецифичным методом диагностики. Кроме того, благодаря особенностям Real-time PCR возможно определить количественное содержание вируса у отдельно взятого животного.

Для проведения ПЦР-исследования необходимо отобрать биологический материал – это может быть как и кровь, так и ткани внутренних органов. Далее, проводят выделение и очистку ДНК.

Подготовка образцов

Выделение ДНК в общем случае проводят путем разрушения (лизиса) клеток, содержащихся в образце (тем самым, высвобождая в том числе и вирусную ДНК) и очистке полученного лизата от белков, жиров и углеводов. Обеспечивается это обработкой образца поверхностно-активными веществами (например, SDS) или хаотропными агентами (напр. гуанидилтиоцианатом) в присутствии протеиназ. Далее, ДНК пререносят на носитель: к лизату добавляют суспензию ионообемнных шариков, или же его пропускают через ионообменную мембрану, на которые специфически «налипают» молекулы ДНК. Носитель с прикрепленными к нему молекулами ДНК отмывают от клеточного дебриса, после чего элюируют («открепляют») ДНК, с помощью растворителя с низкой ионной силой, чаще всего MQ-водой. На выходе получается высокоочищенный раствор ДНК, пригодный для проведения анализа.

Амплификация

На этапе ПЦР необходимо подобрать специфическую для данного возбудителя пару праймеров – они должны обеспечить амплификацию уникального для данного вируса гена/локуса. В случае, если проводят Real-time PCR, возможно определить количество ДНК вируса в образце. Однако, для того, чтобы оценка количества ДНК вируса была достоверна, необходимо соблюсти ряд условий:

Для анализа необходимо отобрать одинаковый тип и количество биоматериала у всех больных или «подозрительных» животных;

• Забор материала должен быть произведен в одно и то же время;
• Выделение ДНК из образцов должно производиться одновременно и одним и тем же методом (набором реактивов);
• ПЦР для всех образцов необходимо проводить в одинаковых реакционных смесях, на одном и том же приборе;
• Если все образцы невозможно проанализировать за один прогон, протокол анализа на приборе должен быть одним и тем же для всех образцов.

Только при соблюдении всех условий возможно получить достоверные данные.

Если же важно установить только факт наличия возбудителя заболевания у животного, данные условия не обязательны.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Кривая амплификации
Кривая амплификации показывает зависимость флуоресценции репортерного красителя от номера цикла. Реакции различаются по времени, когда возможно обнаружить продукты амплификации. Чем больше изначальное количество ДНК-матриц в исследуемом образце, тем раньше возникнет достаточная для детекции флуоресценция.

Базовая линия
Во время начальных циклов реакции наблюдаются фоновые флуоресцентные сигналы. В соответствие с этим фоном необходимо настроить значение базовой линии.

Дельта Rn
Значение ΔRn представляет собой разницу значений Rn и базовой линии.

Референтный краситель
Краситель, который создает внутреннюю референтную флуоресценцию, по отношению к которой можно нормализировать репортерную флуоресценцию. Нормализация необходима для того, чтобы скорректировать флуктуации, связанные с различиями концентраций компонентов реакционной смеси, объема и особенностей образца.

Эффективность ПЦР
Следующая формула описываю прохождение ПЦР:
Cn=Ci*(1+E)n , где
Ci – начальное количество ДНК-матрицы,
Cn – количество ампликонов на цикле n,
n – количество циклов,
E – эффективность данной реакции.
Если эффективность максимальная (=1), тогда формула приобретет вид Cn=Ci*2n, при этом количество продуктов реакции (ампликонов) будет увеличиваться в 2 раза с каждым циклом. Если эффективность ниже, то каждый цикл ампликоны будут синтезироваться в меньшем количестве, что отобразиться на кривой амплификации. Оптимальная эффективность – от 90 до 110%.

Репортерный краситель
Репортерный краситель связан с 5’-концом зонда TaqMan®. При гибридизации зонда с ДНК-матрицей, этот краситель дает флуоресцентный сигнал, сигнализирующий об успешной гибридизации. Если используется краситель SYBR® Green , то сигнал последует при интеркалляции красителя в двухцепочечеую ДНК, что свидетельствует об успешной амплификации. Специфичность связывания с целевой последовательностью ДНК необходимо проверить по кривой плавления продуктов реакции, либо на гель-электрофорезе.

Rn
Значение Rn представляет собой отношение интенсивности флуоресценции репортерного красителя к интенсивности флуоресценции референтного красителя.

Пороговое значение (пороговая линия, порог чувствительности)
Это значение ΔRn для CT в данном виде анализа. Порог чувствительности настраивается таким образом, чтобы он был выше базовой линии, но при этом кривая амплификации должна пересекать его в самом начале экспоненциальной фазы.

Пороговый цикл (CT)
Цикл, во время которого кривая амплификации пересекает пороговое значение.

Внимание! Статья адресована врачам-специалистам

KostiukS.A.

Belarusian Medical Academy of Post-Graduate Education, Minsk

Laboratory errors and risk management in the molecular genetic laboratory

Резюме. Тема лабораторных ошибок при проведении молекулярно-генетических исследований, в том числе методом ПЦР в режиме реального времени, очень сложна и не изучена специалистами лабораторной диагностики в виде отдельного направления в системе менеджмента качества. Она не обсуждается в практических кругах, не освещается в специальной медицинской литературе, научных публикациях. Разрозненные знания, отсутствие навыков аналитического анализа и участия в решении научных задач не позволяют специалистам молекулярно-генетических лабораторий практического здравоохранения эффективно организовать работу по выявлению лабораторных ошибок, которые могут быть на любом из этапов, носить методический или аналитический характер. Разработать единую типовую модель борьбы с лабораторными ошибками при проведении ПЦР-исследований сложно, поскольку каждая лаборатория может отличаться по организационной структуре, видам оборудования, используемым реагентам, перечню исследований. В этой связи необходимо на основе научного анализа возможных лабораторных ошибок сформировать профессиональное мышление у врачей лабораторной диагностики, работающих в практическом здравоохранении.

Ключевые слова: полимеразная цепная реакция в режиме реального времени, преаналитический, аналитический и постаналитический этапы, методические и аналитические лабораторные ошибки.

Медицинские новости. – 2021. – №1. – С.6–10.

Summary. The topic of laboratory errors in molecular genetic researches, including real-time PCR, is very complex and has not been studied by laboratory diagnostics specialists as a separate area in the quality management system: it is not discussed in practical circles, it is not covered in special medical literature or scientific publications. Scattered knowledge, lack of analytical analysis skills and lack of participation in solving scientific problems do not allow the specialists of practical health care molecular genetic laboratories to effectively organize the work to identify laboratory errors, which can be at any stage, of a methodical or analytical nature. It is difficult to develop a single standard model for fighting laboratory errors during PCR studies, since each laboratory may differ in organization structure, types of equipment, reagents and the list of studies. In this regard, it is necessary, on the basis of a scientific analysis of possible laboratory errors, to form professional thinking among laboratory diagnostics doctors working in practical health care.

Keywords: real-time PCR, preanalytical, analytical and postanalytical stage, methodological and analytical laboratory errors.

Meditsinskie novosti. – 2021. – N1. – P.6–10.

Лабораторные методы диагностики сложно унифицировать, поскольку каждый из них имеет свои технические и диагностические особенности. Это в полной мере относится и к молекулярно-биологическим методам лабораторной диагностики в практическом здравоохранении, которые включают в себя полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с электрофоретической детекцией, с детекцией по конечной точке, в режиме реального времени [7, 8]. Современный уровень технического прогресса в лабораторной медицине способствует снижению количества лабораторных ошибок, и если при внедрении в клиническую практику первого молекулярно-биологического метода – ПЦР с электрофоретической детекцией – исследователи сталкивались с проблемой контаминации, то есть с ложноположительными результатами, в настоящее время наиболее востребованным в практическом здравоохранении является ПЦР в режиме реального времени, что позволило создать для этого метода репутацию очень надежного исследования [4, 6]. Однако в реальности данное убеждение не является верным по своей формулировке.

Многие врачи лабораторной диагностики считают, что правильное выполнение исследований не должно приводить к ошибкам, и потому соблюдение инструкций к диагностическим тест-системам – это порой единственное, чем руководствуется сотрудник клинико-диагностической лаборатории. Однако не все тест-системы могут быть одинаково устойчивы к контаминации, могут иметь разный предел обнаружения. В этой связи врач лабораторной диагностики должен знать слабые стороны используемой тест-системы и организовать свою работу так, чтобы свести к минимуму вероятность возникновения недостоверного результата. Важно также учитывать материально-техническую базу, количество производимых исследований, копийность биологического материала.

Причины и механизмы формирования лабораторным ошибок при проведении исследований методом ПЦР в режиме реального времени слишком сложны, чтобы их интуитивно понимать. Учитывая, что в практическом здравоохранении в ПЦР-лабораториях трудятся не научные сотрудники, а врачи, то им будет важно понимать, что происходит на их конкретном рабочем месте, и планировать свою работу над ошибками. В условиях рутинной ежедневной практики ошибка не воспринимается как научный феномен со своими причинами и механизмами формирования, это вопрос поиска виноватых. В этом случае, поскольку речь идет о качестве работы лаборатории, всю ответственность возлагают на сотрудников лаборатории [5].

Диагностические ошибки могут быть различные, это зависит как от природы исследуемого биологического материала, так и от технологических особенностей исследования. Например, при использовании в диагностической медицинской лаборатории методического подхода к анализу результатов на основе флуоресцентной детекции по конечной точке и ПЦР в режиме реального времени выявление нуклеиновых кислот одних и тех же микроорганизмов может сопровождаться разными результатами, обусловленными различным пределом обнаружения данных диагностических тест-систем.

Всегда ли использование диагностикумов с высоким пределом обнаружения является достаточным дополнительным «защитным» фактором от недостоверных результатов? Считаем, что нет, и число допускаемых ошибок в диагностической лаборатории можно уменьшить только путем повышения профессионализма сотрудников. Неподготовленному специалисту трудно разобраться в преимуществах и недостатках различных технологий, определиться с их выбором, оценить правильность и рациональность организации технологического процесса, а также поддержать его на приемлемом уровне. Проблема образования становится более очевидной в связи с тем, что сотрудники, пройдя краткосрочное обучение на курсах повышения квалификации (1 месяц), проводят исследования не только по детекции нуклеиновых кислот возбудителей инфекционных заболеваний, но и занимаются медицинской генетикой. Также одним из популярных направлений в молекулярной лабораторной диагностике стало создание «домашних» тест-систем – inhouse тест-систем, которые в лабораториях самостоятельно разрабатываются и валидируются, а для этого, безусловно, важна квалификация специалиста [7].

Ошибками можно считать:

1) оказание некачественной лабораторной услуги, сопровождающееся возникновение ложного результата, которые могут быть ложноположительными и ложноотрицательными;

2) оказание некачественной диагностической услуги, например, в случае использования метода ПЦР при верификации диагноза, когда он не является диагностически обоснованным методом исследования.

Опыт появления ПЦР в 2000-х годах в Республике Беларусь сопровождался ложноположительными результатами, что было существенным ограничением широкого распространения этого метода в клинической лабораторной диагностике. В настоящее время после 20 лет применения ПЦР-исследований ситуация изменилась: для установления многих заболеваний, уточнения фазы течения заболевания, оценки эффективности лечения, клинической и микробиологической излеченности ПЦР является важным диагностическим инструментом [4, 7, 8]. Однако данную ситуацию не следует рассматривать как проявление наступившей безупречности молекулярно-биологических методов исследования.

Понятие «ложноположительный» результат определяется понятием «диагностическая специфичность», которая рассчитывается по формуле [1, 5]:

Диагностическая специфичность

(ДС)= 

где ИО – истинно отрицательный результат теста, ЛП – ложноположительный результат теста.

Эта формула характеризует вероятность отрицательного результата при отсутствии болезни. При 100% специфичности тест не относит здоровых людей к категории больных и ложноположительные результаты отсутствуют.

Однако «специфичность» не является однозначной лабораторной характеристикой, поскольку в зависимости от причин ложноположительных результатов принято разделять аналитическую и диагностическую специфичность, что особенно важно для ПЦР-исследований [2, 3]. Под 100% аналитической специ-фичностью понимают отсутствие амплификации нуклеиновых кислот других микроорганизмов и человека, способность детектировать специфический флуоресцентный сигнал выше порогового значения в положительных образцах и отсутствие его в отрицательных образцах, то есть неспособность тест-системы выявлять исследуемый фрагмент ДНК, характерный для возбудителя инфекционного заболевания, у здорового человека [3, 5, 7]. Аналитическая специфичность может меняться при применении различных олигонуклеотидных последовательностей праймеров и молекулярных зондов, тогда как диагностическая специфичность обусловлена совокупностью причин, действующих в условиях лабораторной практики, среди которых наиболее важной является контаминация.

Аналитическая специфичность – обязательный параметр валидации тест-системы и должна составлять 100%, но методы ее определения не совершенны. Каким образом происходит выбор последовательности праймеров и молекулярных зондов при разработке новой тест-системы? Первый этап: выбор осуществляется in silico с использованием электронных баз данных для исключения перекрестных реакций с известными ДНК и РНК других микроорганизмов. Вторым этапом выбранные последовательности проходят тестирование in vitro с использованием узкого числа возбудителей инфекционных заболеваний, что, однако, не может полностью исключить перекрестные реакции и, соответственно, ложноположительные результаты. Безусловно, это явление не распространенное и зависит от вида исследуемого биологического материала. В литературе можно встретить информацию о перекрестных реакциях при выявлении ДНК Neisseria gonorrhoeae, так как для вируса гепатита С таких публикаций нет [1, 13]. Это можно объяснить присутствием в исследуемом биологическом материале из урогенитального тракта комменсальных диплококков рода Neisseria spp., обменивающихся генетическими элементами с Neisseria gonorrhoeae, и появлением таким образом популяций Neisseria spp., обладающих генетической гомологией, критичной для использования данной тест-системы. Такая ситуация исключена для РНК вируса гепатита С. Ряд авторов объясняет снижение аналитической специфичности, обусловленное биовариацией микроорганизма [11], поэтому некоторые коммерческие тест-системы с течением времени при длительном их использовании могут терять свою аналитической специфичность.

Диагностическая специфичность обратно пропорционально отражает частоту ложноположительных результатов при реальном использовании тест-системы. Диагностическая специ-фичность зависит от аналитической специфичности. Однако существуют другие причины ее снижения. Одной из возможных причин ложноположительных результатов в ряде случаев может быть использование интеркалирующих красителей, особенность которых заключается в их способности без дифференциации связываться с любой ДНК. При этом накопление неспеци-фических продуктов амплификации может повлечь за собой заблуждение об истинном результате исследования в данном биологическом материале. При образовании димеров праймеров могут синтезироваться короткие ампликоны, при этом регистрация накопления продуктов амплификации возникает даже без участия целевой специфической нуклеиновой кислоты. В этом случае типичная положительная S-образная флуоресцентная кривая формируется только на поздних циклах амплификации (после 30-го цикла), поэтому следует исключить регистрацию и использование диагностических тест-систем для ПЦР в режиме реального времени на основе интеркалирующих красителей.

Наиболее часто причиной появления ложноположительных результатов выступает контаминация [9]. Возможная контаминация не является оцениваемым техническим параметром при клинических испытаниях и регистрации тест-системы, поскольку это показатель, по которому следует оценивать качество работы сотрудников лаборатории. В то же время устойчивость к контаминации диагностической тест-системы является важным техническим показателем, который следует определять при проведении межлабораторных испытаний или тестировании диагностикума в референтной лаборатории [10]. Частота ложноположительных результатов при проведении ПЦР-исследований зависит от «человеческого фактора» в выполнении технологического процесса в лаборатории, поэтому важно предусмотреть некоторые особенности использования тест-системы, которые позволят снизить влияние этого фактора и уменьшат вероятность получения ложноположительных результатов. По данным H. Zitzer, G. Heilek, K. Truchon и соавт. [15], возможно создать тест-системы, устойчивые к контаминации. Данные технологические особенности следует рассматривать как их бесспорное преимущество. В этой связи диагностическая специфичность может являться важным критерием для оценки качества тест-системы, и только более высокая себестоимость выполнения данных тестов является для многих лабораторий непреодолимым препятствием для их широкого практического применения.

Определение диагностической специ-фичности является сложным процессом, поскольку ложноположительные результаты могут регистрироваться не сразу, а по прошествии некоторого времени работы с данной тест-системой, поэтому диагностическая специфичность имеет очень неоднозначную оценку. Данный показатель должен определяться в ходе клинических испытаний в рамках государственной регистрации, в то же время методы ее оценки не совершенны.

Уровень возможной контаминации можно выражать в проценте постановок реакций амплификации, при которых выявлен хотя бы один положительный результат, или как доля ложноположительных результатов среди контрольных отрицательных образцов, или как доля ложноположительных результатов среди клинических биологических образцов, не содержащих специфическую нуклеиновую кислоту, которая является матрицей для амплификации [11, 15].

С практической точки зрения важно знать не только то, что тест-система эффективно детектирует конкретный микроорганизм с минимальным количеством ложноположительных результатов, что и определяется понятием «специфичность», но и иметь уверенность, что выявленный микроорганизм является этиологическим фактором заболевания в каждом конкретном клиническом случае при положительном результате теста. В качестве примера можно вспомнить условно-патогенные микроорганизмы, которые при концентрации выше диагностически значимой (пороговой), являются этиологической причиной воспалительного процесса. Специалисту клинического профиля необходимо иметь представление, насколько выявленный микроорганизм способен выступать в качестве этиологического фактора в данном конкретном клиническом случае при положительном результате теста. Для этого важно иметь высококопийный положительный результат (более 10³ копий/мл), в то время как низкокопийные образцы не имеют диагностической ценности. Для этого важно использовать лабораторный показатель – предсказательная ценность положительного результата.

Выявление ложноположительных результатов в практике является единственным способом визуализации процесса контаминации на практике. Но всегда ли контаминация в лаборатории сопровождается появлением ложноположительных результатов? По-нашему мнению, контаминация может быть скрытой и не приводить к появлению ложноположительных результатов. Поскольку каждая тест-система имеет свой порог (предел) обнаружения специфической ДНК, установка производителем высокого порога обнаружения искомой молекулы ДНК для своего диагностического набора позволит не определить низкие концентрации контаминационной молекулы ДНК как положительный результат лабораторного исследования. Ложноположительные результаты в данном случае следует воспринимать как надводную, меньшую часть айсберга. В процессе работы клинико-диагностической или научной лаборатории персонал может столкнуться с проблемой контаминации лабораторных поверхностей, дозаторов и даже лабораторного оборудования. Помня о возможности перемещения контаминационной молекулы ДНК с потоками воздуха, через контакты с одеждой, кожные и волосяные покровы, следует понимать, что контаминация – это неприятное, но, в то же время вполне возможное лабораторное событие.

Поэтому работа в лаборатории, использующей молекулярно-биологические методы диагностики, должна проводиться в режимных условиях с целым комплексом профилактических мер, направленных на недопущение возникновения контаминации и препятствие ее распространения, включая мониторинг для своевременного выявления неконтролируемой контаминации, тщательно фиксируя случаи ложноположительных результатов. В случае отсутствия ложноположительных результатов можно заключить, что, даже если контаминация и есть, ее распространение находится под контролем. Если в деятельности лаборатории регистрируются ложноположительные результаты, это указывает на то, что проводимых мероприятий недостаточно, необходимо выявить причины и принять меры, направленные на их устранение и на клиренс уже распространившейся контаминанты. Неоспоримым фактором контаминации является регистрация положительного результата в отрицательном контрольном образце.

Персонал лаборатории должен уметь своевременно отличить истинно положительные результаты от ложноположительных, а также определить причину и механизм возникшей контаминации. Для того чтобы устранить контаминацию, необходимо понять, что послужило контаминантой: ампликоны или нативная ДНК. Решить данный вопрос весьма проблематично, поскольку нет патогномоничных признаков. Ампликоны можно признать наиболее контагиозной из всех возможных контаминант, при этом происходит их ретроградный перенос из зоны ПЦР или пост-ПЦР в пре-ПЦР – это вертикальная, или внутренняя контаминация. При контаминации нативной ДНК задействуются ресурсы пре-ПЦР-зоны, когда контаминанта, не нарушая правил поточности, проходит этап амплификации – это горизонтальная, или внешняя контаминация. Важно охарактеризовать контаминацию посимптомно: низкокопийная или высококопийная, спорадическая или тотальная. Признаком тотальной контаминации является фиксация положительного результата в двух и более отрицательных контрольных образцах, спорадической – появление искомой ДНК лишь в одном отрицательном контрольном образце данной постановки. В случае, если контаминация вызвана нативной нуклеиновой кислотой, необходимо понять, каков механизм распространения контаминанта, чтобы конкретизировать свою тактику и наиболее эффективно провести мероприятия ликвидации контаминации.

Важно помнить, что контаминанта не может существовать сама по себе и ассоциирована с каким-либо носителем. Исключение составляют случаи, когда контаминанта переносится в воздухе, но это временное ее состояние, обязательно заканчивающееся осаждением на какой-либо объект. Любая контаминанта имеет первичный источник, то есть объект, который содержит ее в наиболее максимальном состоянии, это может быть пробирка с биологическим материалом или пробирка с ампликонами. Персоналу необходимо четко представлять, какой из объектов в лаборатории может выступать в качестве первичного источника контаминанты, чтобы с особым вниманием отнестись к нему во время проведения исследования с соблюдением всех мер предосторожности при обращении с ним. По мере распространения контаминанты в пределах лаборатории она охватывает новые территории, но ее концентрация при этом снижается. Те ареолы лаборатории, которые обсеменены контаминантой, являются очагом контаминации. Если первоначально не ликвидировать наиболее концентрированные скопления контаминанты в очаге – первичный источник, высококопийные вторичные источники контаминации, то итоговая эффективность деконтаминационных мероприятий будет низкой. Это устанавливает порядок деконтаминации, которую следует проводить поочередно: в начале – мероприятия в отношении наиболее концентрированных, а затем – в отношении менее концентрированных источников контаминации. Частота высококопийных контаминаций значительно ниже частоты низкокопийных. Наиболее часто контаминация проявляется регистрацией ложноположительного результата на поздних циклах амплификации. Более точная дифференцировка ложно- и истинно положительного результата возможна при повторном исследовании с проведением дублирования амплификации.

Для того, чтобы определить зоны с наиболее высокой концентрацией контаминанты, необходимо проводить внеплановые смывы, тестирование которых оправдано как в целях расследования механизмов контаминации, так и при оценке эффективности деконтаминационных мероприятий.

У каждой контаминации есть свой предел обнаружения, то есть та концентрация контаминанты, которая является максимально возможной в ложноположительном образце. Все результаты, когда регистрируемая концентрация искомой ДНК ниже предела обнаружения контаминации, должны рассматриваться как потенциально ложные, их следует повторно исследовать из резервного образца биологического материала – аликвоты. Считаем, что значения предела обнаружения внешней контаминации должен определять производитель тест-систем и предоставлять эти данные в инструкции к ней.

Риск контаминации биологических проб снижается при регулярных превентивных деконтаминационных мероприятиях, включая проведение текущей и генеральной уборки, ультрафиолетовое облучение рабочих зон. Поскольку существуют объекты труднодоступны для деконтаминации – штативы для наконечников, медицинский вакуумный отсасыватель, емкости для сбора наконечников, бумажные носители информации, следует проводить их периодическую замену, так как они являются местом сорбции и способны стать вторичным источником контаминанты.

Термин «перекрестная контаминация» обозначает внешнюю контаминацию в случае распространения от биологической пробы к биологической пробе. «Перекрестное реагирование» происходит в случае, если праймеры и зонды тест-системы сконструированы таким образом, что тест-система способна выявлять и детектировать не только заявленный возбудитель, но и другие виды микроорганизмов. Это указывает на то, что «перекрестное реагирование» не является синонимом термина «перекрестная контаминация».

В некоторых случаях источником контаминации может стать сотрудник клинико-диагностической лаборатории, особенно если объектом исследования является участок генома человека, поэтому следует соблюдать особую осторожность при проведении диагностических манипуляций. Обязательным является использование масок, медицинской шапочки, перчаток, исключение прикосновения к пробиркам, содержащим компоненты тест-систем без перчаток, поскольку ДНК самого сотрудника может стать контаминантой.

В коммерческих тест-системах контрольные образцы искомой (положительной) ДНК содержатся в невысоких концентрациях и укладываются в диапазон линейности теста. В этой связи их можно рассматривать как обычные биологические образцы, а контаминацию с их участием считать горизонтальной. Контаминацию реагентов следует рассматривать как возможное явление при любой контаминации, это вторичный источник контаминации, который может включать контаминацию воды и расходного материала. В качестве превентивных деконтаминационных мероприятий важно использовать пластик и реагенты с маркировкой DNA—free.

Профилактика контаминации должна включать общелабораторные меры, которые включают:

– отказ от открытых систем детекции результатов, использование тест-систем на основе ПЦР в режиме реального времени;

– соблюдение требований по организации работ в ПЦР-лаборатории, зонирование лабораторных этапов в соответствии с принципами поточного движения исследуемых биологических проб согласно последовательности прохождения ими этапов анализа; запрет на использование оборудования и расходных материалов за пределами той зоны, в которой предусмотрена их эксплуатация; разделение видов работ в отношении риска инициации контаминации и выполнение их в особых помещениях, смена спецодежды и гигиеническая обработка рук при перемещении между зонами;

– использование тест-систем с пределом обнаружения от 10² копий ДНК;

– использование одноразового пластика и других расходных материалов для проведения ПЦР-исследований;

– регулярная текущая и генеральная уборка с проведением мероприятий по дезактивации контаминанты;

– проведение внутрилабораторного контроля качества и участие во внешнем контроле качества.

Специальные меры профилактики контаминации.

1. Наличие отлаженной системы утилизации пробирок с ампликонами.

2. Использование UNG-протокола на основе урацил-N-гликозилазы – фермента, участвующего в репарации ДНК и вызывающего гидролиз цепи ДНК по остаткам урацила. При этом в ПЦР-смесь дезокситимидинфосфат заменяется на дезоксиуридинфосфат, поэтому ампликоны становятся чувствительными к UNG-гидролизу, после чего ампликоны не способны быть матрицей для последующей реакции амплификации. В случае неполной денатурации UNG, это может сопровождаться гидролизом исследуемых фрагментов положительной пробы и снижением чувствительности метода. Неполностью разрушенные с помощью UNG ампликоны, контаминируя пробы биологического материала пациентов, способны конкурировать с искомой нуклеиновой кислотой за праймеры, что обусловливает снижение чувствительности тест-системы и появление ложноотрицательных результатов.

3. Автоматизация процедуры экстракции нуклеиновых кислот, которая позволяет сократить частоту ложноположительных результатов до 1/400 [14]. Автоматизация ПЦР способствует уменьшению требуемых производственных площадей лаборатории, устранению дефицита кадров.

4. Сокращение числа этапов ПЦР, при выполнении которых требуется открывать пробирки. Современные тест-системы позволяют выполнять этап обратной транскрипции и амплификации в объединенной амплификационной смеси как один единый этап.

5. Ограничение количество исследуемых образцов в одну постановку до 12.

6. Ограничение количества циклов амплификации.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. Костюк С.А. // Медицинские новости. – 2012. – №4. – С.16–19.

2. Костюк С.А. Клиническая лабораторная диагностика ассоциированных инфекций урогенитального тракта: Монография. – Минск, 2012. – 306 с.

3. Костюк С.А. // ARS medica (клин. лаборатор. диагностика). – 2010. – №4. – С.43–50.

4. Костюк С.А. Молекулярно-биологические методы в медицине: Монография. – Минск, 2013. – 327 с.

5. Костюк С.А., Коломиец Н.Д. // Медицинские новости. – 2008. – №15. – С.96–101.

6. Костюк С.А. // Весцi Нац. Акад. навук Беларусi. Сер. бiял. навук. – 2006. – №4 – С.103–112.

7. Костюк С.А. // Медицинские новости. – 2016. – №4. – С.11–14.

8. Теоретические и прикладные вопросы применения методов анализа нуклеиновых кислот: монография / С.А. Костюк, Н.Д. Коломиец, Т.В. Руденкова, О.С. Полуян. – Минск, 2014. – 272 с.

9. Borst A., Box A.T., Fluit A.C. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. – 2004. – Vol.23, N4. – P.289–299.

10. Burd E.M. // Clin. Microbiol. Rev. – 2010. – Vol.23, N3. – P.550–576.

11. Greub G., Sahli R., Brouillet R., et al. // Future Microbiol. – 2016. – Vol.11, N3. – P.403–525.

12. Tabrizi S.N., Unemo M., Limnios A.E., et al. // J. Clin. Microbiol. – 2011. – Vol.49, N10. – P.3610–3615.

13. Upton A., Bromhead C., Whiley D.M. // J. Clin. Microbiol. – 2013. – Vol.51, N5. – P.1609–1610.

14. Wilke W.W., Jones R.N., Sutton L.D. // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. – 1995. – Vol.21, N4. – P.181–185.

15. Zitzer H., Heilek G., Truchon K., et al. // J.Clin. Microbiol. – 2013. – Vol.51, N2. – P.571–577.

Медицинские новости. – 2021. – №1. – С. 6-10.

Внимание! Статья адресована врачам-специалистам. Перепечатка данной статьи или её фрагментов в Интернете без гиперссылки на первоисточник рассматривается как нарушение авторских прав.

Полимеразно-цепная реакция, пожалуй, один из самых чувствительных и наиболее точных методов диагностики различных инфекционных заболеваний, особенно, передающихся половым путем. Определяя даже незначительное количество частиц ДНК бактерий, вирусов, грибов, ПЦР является и достаточно специфичным методом, редко дающим ложноположительные результаты.

Ложноположительный результат означает, что на самом деле инфекции нет, а реакция положительная.

Но, даже имея 98-99% точности, при ПЦР иногда также бывают неверные ответы, которые практически никогда не связаны с самой реакцией, а больше с нарушениями на предварительном этапе.

Причины ложноположительного результата анализа ПЦР:

• Не выдержаны сроки для проведения контрольных анализов после лечения половых инфекций. Дело в том, что большинство инфекций находятся внутри клеток или фиксированы на поверхности их мембран. Во время полноценного лечения возбудитель ИППП погибает, но частицы его генома (ДНК) остаются еще некоторое время в организме хозяина. Нужно время, порядка 3 недель, чтобы эти клетки заменились на новые, не контактировавшие с инфекционным агентом, тогда и берется контроль. Если же взять анализ раньше, то, благодаря своей высокой чувствительности, ПЦР определит ДНК уже погибших бактерий и укажет на наличие возбудителя, что будет являться ложноположительным, так как инфекция уже погибла.
  Наши врачи обладают достаточными знаниями в области диагностики ЗППП и выдерживания сроков, поэтому такие ситуации в клинике Частная практика исключены.
• Попадание ДНК инфекций, передающихся половым путем, в пробирку с рук венеролога, с перчаток и урологических зондов.
  Данный фактор исключен, так как для забора материала используются только одноразовые перчатки, пробирки и зонды.
• Крайне редко встречаются ложноположительные результаты при наличии в соскобе близкородственных микроорганизмом. То есть анализатор выдает наличие патогенной бактерии, вызывающей венерическое заболевание, а на самом деле это компонент нормальной микрофлоры. Но эта проблема уже давно решена внедрением более современных и специфических тест-систем.
• Контаминация или занесение ДНК инфекций в пробирку на лабораторном этапе исследования тоже был когда то возможен, но практически исключен правильной организацией процесса диагностики и обучением персонала.

В любом случае диагноз ставится всегда не только на основании результатов одного анализа. Окончательный диагноз заболевания, передающегося половым путем, это совокупность жалоб, клинического осмотра и комбинации различных лабораторных и инструментальных методов.

Если у уролога, гинеколога или венеролога появляются сомнения в правильности полученных результатов ПЦР или выявляется несоответствие имеющейся клинической картины и данных лабораторной диагностики между собой, то врач всегда порекомендует дообследование с применением методов ИФА, НАСБА, посевов, с целью уточнения ситуации.

В наших клиниках есть все доступные современной медицине методики обследования мужчин и женщин. Поэтому установление ложных диагнозов ИППП исключено.

Врач клиники «Частная практика» дерматовенеролог, уролог Волохов Е.А. рассказывает об анализе ПЦР на инфекции.