Генетика довольно молодая наука. Однако ее доказательный потенциал огромен. С помощью генетического анализа расследуют преступления, устанавливают родство, диагностируют болезни. Факты эффективности генетики подвержены миллионами тестов. Наша ДНК неизменна на протяжении всей жизни и является уникальной.
Может ли ДНК-тест выдать ошибочный результат?
В зависимости от вида исследования анализу подвергаются разные участки генома, отдельные гены или целые хромосомы. Вероятность появления ошибки в большинстве случаев зависит от человеческого фактора.
При установлении отцовства горе-генетик может перепутать пробирки или неправильно интерпретировать данные от анализатора. Но если все сделать правильно, то тест будет абсолютно верным.
Существуют случаи, когда у ребенка возникают редкие мутации и появляется расхождение в локусах. Но опытный эксперт заметит это и просит предоставить образцы матери. Если предполагаемые отцы являются однояйцевыми близнецами, то экспертиза может показать неопределенные данные. Но и тут хороший генетик заметит подвох и разберется в ситуации. В ДНК лаборатории «ИнЛаб Генетикс» работают лучшие специалисты с многолетним опытом в области ДНК анализа. Ошибается ли тест ДНК на отцовство? Сама методика нет, но человеческий фактор может сыграть свою роль.
При выявлении хромосомных отклонений или моногенных заболеваний также многое зависит от человека. Как правило процессы автоматизированы и оплошностей быть не может.
Лаборатория, которая ценит свою репутацию и своих клиентов проводит параллельныетесты разными специалистами. Затем результаты сравниваются. Двойной контроль снижает риски человеческого фактора практически до нуля.
Не стоит забывать об условиях забор генетического материала. Если пациент сознательно идет на обман и приносит заведомо ложные образцы, то тест на родство будет выполнен именно по этим образцам. Конечно, если это биообразцов одного человека, грязные или не того пола, специалист сразу это заметит.
Возможные причины погрешности при генетическом исследовании.
Как уже упоминалось выше, самая главная причина погрешности любой экспертизы — это человека:
- Плохо собранный генетический материал.
- Контаминация.
- Сознательный обман.
- Нерадивость генетика.
При правильной загрузке оборудования экспертиза не может быть ошибочной. Данные будут точными согласно предоставленным образцам ДНК.
Надо учитывать рекомендации и ограничения для определённых видов тестов. НИПТ можно делать, начиная с 9-й недели беременности, когда концентрация ДНК плода достигает достаточных значений. Иначе можно получить ложный результат.
Результаты тестов могут быть проверены разными методами диагностики. Например, NGS можно проверить с помощью real-time ПЦР. ДНК лаборатория «InLab Genetics» обладает оборудованием для контроля результатов анализа и проверки данных.
Как правильно нужно собирать слюну для генетической экспертизы, чтобы установить близкое родство?
Забор биоматериала для проведения генетической экспертизы осуществляется следующим образом:
- Необходимо приобрести стерильные гигиенические ватные палочки. При этом упаковка с палочками должна быть новой и не вскрывавшейся ранее.
- Все предполагаемые родственники (дети и родители) должны прополоскать рот чистой водой.
- Каждый из обследуемых лиц должен взять ватную палочку за один конец и вторым концом провести 20-30 раз по внутренней поверхности щеки с легким нажимом для соскабливания клеток эпителия. От каждого лица следует отобрать по две ватные палочки с образцами буккального эпителия. Все образцы от разных людей должны быть в отдельных конвертах для исключения взаимного переноса биологического материала. Запрещается использовать полиэтиленовые пакеты.
- После отбора двух образцов от каждого из обследуемых необходимо отрезать и выбросить второй конец палочки, за который человек держался рукой. Оставшуюся половину палочки следует поместить в маленький бумажный конверт. Всего должно быть 3 (три) бумажных пакета по числу обследуемых образцов биологического материала.
Из каких образцов биологического материала можно выделить ДНК для исследования?
ДНК человека может быть выделена из любых выделений или тканей человеческого организма (слюна, сперма, волосы, ногти и так далее). Также ДНК можно легко выделить из любого материала, находившегося в контакте с человеческими выделениями (жевательная резинка, окурки сигарет, женские прокладки, простыни, одежда и так далее). Мы можем произвести исследование со всеми вышеперечисленными образцами биологического материала.
Как провести тест, если в нашем городе нет представительства Вашей компании?
Воспользовавшись нашей инструкцией «Процедура изъятия образцов для генетической экспертизы», Вы можете самостоятельно собрать биологический материал и отправить его к нам по почте. Далее Вы оплачиваете исследование на указанные нами реквизиты. После получения средств и проведения исследования мы высылаем «Заключение специалиста» на любой указанный Вами почтовый адрес.
Отец ребенка отказывается предоставить свои образцы ДНК? Что делать?
В вашем случае для проведения генетического исследования можно предоставить образцы ДНК близких родственников отца ребенка: матери, сестры, брата, тети и т.д. С их помощью возможно определить степень родства.
Правда ли, что при переливании крови генетическое тестирование не будет являться достоверным?
Нет, это ошибочное мнение. ДНК человека остается неизменным на протяжении всей его жизни. Переливание крови эти данные не меняет.
Можно ли тайно срезать волосы у ребенка и передать их эксперту для анализа ДНК?
Волосы, которые используются для анализа ДНК, должны непременно иметь луковицу на корне, и волосков должно быть 5-6. В случае тайного забора биоматериала без присутствия медперсонала и подтверждения забора заключение не будет иметь юридической силы, а его результаты будут иметь вероятностный характер.
Обязательны ли образцы ДНК матери при производстве теста на отцовство?
Нет, не обязательны. Чтобы получить достоверные результаты при производстве теста на отцовство, нет необходимости брать образцы от матери ребенка.
Можно ли в судебном порядке провести анализ ДНК, если ребенку уже исполнилось 12 лет?
Да, анализ ДНК возможен. Возраст ребенка не влияет на результаты экспертизы ДНК.
Нужно ли ограничивать себя в приеме пищи перед забором образцов ДНК?
Перед забором образцов для экспертизы ДНК необходимо ограничить прием любой пищи не менее чем за один час до проведения данной процедуры.
Каковы сроки проведения генетической экспертизы?
Сроки выполнения экспертизы зависят от типа заказываемого Вами исследования. Например, стандартное трио (мать-ребенок-предполагаемый отец) с биоматериалом в виде буккального эпителия проводится в течение 6-7 дней, определение родства с биоматериалом в виде ногтевых пластинок — 8-9 дней, определение родства по костным останкам — до одного месяца.
Каким образом нужно брать кровь для проведения генетической экспертизы?
Если экспертиза проводится для суда, то забор крови должен быть произведен медсестрой в присутствии еще двух медицинских работников медицинского учреждения. Все это должно быть задокументировано (т.е. должны быть составлены акты, в которых указаны название медцентра, ФИО медсестры и свидетелей с указанием занимаемой должности). Конверт с материалом должен быть запечатан и опломбирован прямо на месте. В запечатаном виде он должен быть передан на экспертизу. Материал (кровь) должен храниться при температуре от 2 до 6 С° (т.е. в холодильнике). При этом ни в коем случае его нельзя замораживать.
В какой форме лингвист-эксперт представляет результаты исследования?
Лингвист-эксперт оформляет результаты проведённой экспертизы в форме экспертного заключения в соответствии с нормами законодательства. В экспертном заключении по результатам лингвистической экспертизы указывается основание проведения экспертизы, список предоставленных на исследование материалов и способ их получения, вопросы, поставленные перед экспертом, сведения об эксперте; исследовательская часть заключения включает в себя описание объектов исследования, методик, применяемых для получения ответа на поставленные вопросы, описание проведённого исследования и полученные в результате проведения лингвистической экспертизы текста выводы.
Предполагаемый отец ребенка умер. В живых остались его дядя и сестра. По кому из них предпочтительнее проводить экспертизу на установление отцовства?
Установление дальнего родства по аутосомным (на не половых хромосомах) локусам в случае сестры предполагаемого отца является затруднительным.
В данном случае правильнее будет исследовать неаутосомные (расположенные на половых хромосомах) локусы. Если дядя предполагаемого отца и отец предполагаемого отца имеют общего отца, то Y-хромосома у всех у них одинаковая. Следовательно, локусы на Y-хромосоме у всех вышеперечисленных мужчин (дед предполагаемого отца, дядя предполагаемого отца, отец предполагаемого отца, предполагаемый отец и сын) будут одинаковыми.
Таким образом, достовернее провести экспертизу по дяде предполагаемого отца.
Есть образцы срезанных волос. Можно ли по ним сделать экспертизу ДНК?
Да, возможно. Однако ядерная (хромосомная) ДНК присутствует только в корнях волос, поэтому для получения достаточного количества ядерной ДНК из волоса необходимо выдернуть как минимум пять волосинок с волосяными луковицами (корнями) для проведения генетической экспертизы. С другой стороны, ствол (стержень) волоса является хорошим источником митохондриальной ДНК, и в случаях, когда нет другого генетического материала, возможно проведение «Генетической экспертизы митохондриальной ДНК».
Экспертиза показала что я являюсь отцом ребенка, но я знаю, что это не так. Могли ли результаты экспертизы быть подделаны?
Если эксперт по биологическому материалу установил отцовство, значит, действительно этот биологический материал принадлежит ребенку и истинному отцу.
Прямое подделывание результатов возможно несколькими способами:
- Биологический материал предполагаемого ребенка, подменили на биологический материал другого (если у Вас имеется ещё один) ребенка.
- Ваш биологический материал, подменили на биологический материал истинного отца.
- Откровенная фальсификация данных: в экспертизе просто написали «нужные» аллели.
Вероятность фальсификации крайне мала и даже существует статьи наказывающие за это правонарушения (статья 57 УПК РФ, статья 310 УК РФ). Поэтому вряд ли бы эксперт согласился на подделывания фактов. С другой стороны биоматериал легче подменить, но в этом случае он должен был попасть в руки заинтересованной стороны, что недопустимо. Проследив путь биоматериала и установив, что он мог попасть в руки заинтересованной стороны, будет правильным ходатайствовать о назначении повторной экспертизы.
Правильнее всего, на наш взгляд, не разбираясь в тонкостях экспертизы и а так же в пути следования биологического материала, произвести повторную генетическую экспертизу.
Здравствуйте, я хотел бы узнать свою гаплогруппу анализом игрек хромосомы, возможно ли это?
Y-хромосомную гаплогруппу можно установить, определив аллельные варианты полиморфных локусов Y-хромосомы. Это возможно сделать в нашей организации.
Насколько достоверны результаты исследования на отцовство?
Точность результатов составляет 100% при получении отрицательного результата, когда мужчина не является биологическим отцом, и 99.99% в случае подтверждения отцовства.
Проводите ли вы ДНК экспертизу эксгумированного трупа? Кто и каким образом осуществляет сбор материала?
Да, проводим. Для проведения экспертного исследования из эксгумированного трупа, как правило, изымаются ногтевые пластинки, волосы и образцы костей. Во многом это зависит от того, на какой стадии разложения находится трупп. Практика показывает, что ядерная ДНК быстро разрушается в тканях умершего организма, поэтому исследование эксгумированного трупа возможно только по митохондриальной ДНК, то есть проводится генетическая экспертиза митохондриальной ДНК.
Если результаты экспертизы предназначаются для суда, то (согласно статье 16 ФЗ 73 от 31.05.2001, а так же ст.85 ГПК РФ) «эксперт не вправе: самостоятельно собирать материалы для производства судебной экспертизы». Как юридически правильно взять биоматериал от эксгумированного трупа, лучше всего будет проконсультироваться с юристами. С другой стороны, можно самому и/или в присутствии других лиц (государственных служащих, судмедэкспертов и т.д.) произвести эксгумацию трупа и взять биоматериал. Но, в этом случае, суд может по своему усмотрению воспользоваться первичным актом судебно-медицинского исследования, выполненному по частному обращению.
Можете ли вы провести экспертизу по установлению отцовства, если потенциальный отец умер? Путем анализа частиц мертвого тела или ДНК живых лиц — родственников по крови, например сестры?
Если потенциальный отец умер, то экспертизу по установлению отцовство провести можно. Выполнить это возможно двумя путями: 1) Взяв биологический материал от умершего предполагаемого отца. Наиболее просто в данном случае, если тело не погребено, отстричь кончики ногтей на пальцах рук. 2) Получив биологический материал от близких родственников предполагаемого отца, например сестры или брата. Обычно у живых лиц берутся образцы буккального эпителия. В обоих случаях исследуются аутосомные полиморфные локусы ДНК.
Какова вероятность (какой процент) установления родства между дедушкой и внуком?
Точность генетической экспертизы по аутосомным локусам в случае родства дедушка-внук, к сожалению, гораздо ниже, чем в случае родства отец-сын. Положительное заключение о родстве принимается при достижении вероятности родства не ниже 80%. С другой стороны, если дедушка по отцовской линии, то лучше всего будет провести анализ, исследуя локусы на Y-хромосоме. В таком случае вероятность родства может составить 99,99% (если предполагаемый дедушка является истинным дедушкой).
Достаточно ли 15 локусов для определения родства братьев по отцу? Можно ли направить их по почте?
15 локусов будет недостаточно для определения полукровного родства (родства братьев по отцу). Если имеется только образцы биоматериала от двух предполагаемых братьев, то нужно анализировать как минимум 20-25 локусов. Лучше всего брать на анализ биоматериал от ещё одного близкого родственника определяемого брата. Вероятность родства высчитывается на основе популяционных данных встречаемости аллелей. Для каждого локуса рассчитывается индекс родства, они перемножаются и составляют комбинированный индекс родства. Из комбинированного индекса родства рассчитывают вероятность родства. Положительное заключение о родстве выдается, если вероятность родства составляет 80% или более. Биоматериал можно отправить по почте.
Возможна ли экспертиза по установлению родства между предполагаемым дядей и племянницей?
Родство между предполагаемым дядей и племянницей установить можно. При этом для трио (предполагаемый дядя — племянница — родственник по другой линии) вероятность получить определенное заключение гораздо выше, чем для дуэта (предполагаемый дядя — племянница).
Проводите ли вы генетическую экспертизу по установлению сводного родства (брат, сестра) от одного отца и разных матерей?
Да, наш центр проводит генетические экспертизы по установлению сводного родства. Для получения более достоверного результата, желательно типировать не только предполагаемых полукровных родственников, но так же их матерей. Если у одной из матерей нельзя получить биоматериал, то можно вместо неё включить в исследование другого, максимально близкого, родственника с её стороны. С другой стороны, вероятность родства более 90% можно получить при исследовании трио — мама ребенка 1/ребенок 1/ребенок 2. Исследуя биоматериал только двух предполагаемых полукровных брата с сестрой, редко можно получить вероятность родства около 90%.
Какой максимальный процент точности возможен при установлении родства между родным братом предполагаемого отца и ребёнком девочкой (дядя-племянница)?
Вероятность генетической экспертизы, в которой участвуют мама-ребенок(девочка)-дядя по отцу, может составлять 99,9%. Принято считать, что при достижении вероятности родства 80% и выше, родство считается доказанным. Кроме вероятности родства, в экспертизе присутствует значение «отношение вероятностей» (LR — likelihood ratio). LR — показывает во сколько раз вероятность прямой гипотезы (исследуемые лица родственники) больше, чем вероятность обратной гипотезы (исследуемые лица не родственники).
На сколько процентов достоверна генетическая экспертиза по установлению отцовства (без проведения эксгумации), если предполагаемый отец погиб, но у него остались брат и мать. Можно ли потом опровергнуть результаты данной экспертизы, если биологический материал возьмут у брата мужа или его матери?
Вероятность генетической экспертизы, в которой участвуют мама, ребенок, предполагаемый дядя по отцу (или бабушка по отцу), может составлять 99,9% (если дядя или бабушка истинные родственники). Если ребенок — мальчик, то мы можем ещё проанализировать маркеры Y-хромосомы, в таком случае аллели локусов Y-хромосомы у ребенка и дяди должны полностью совпасть (если это истинный дядя). Вероятность генетической экспертизы так же будет около 99,9%.
У меня есть сестра, можно ли определить от одного ли мы отца? Что для этого нужно?
Для того, чтобы узнать от одного ли отца произошли Вы с Вашей сестрой или нет, нам понадобится образцы щечного эпителия Вас, Вашей сестры и матери. Если можно взять образец щечного эпителия Вашего отца, то и его тоже. Образцы Вы можете собрать дома самостоятельно и привести к нам, или сдать в нашем центре. Полученные образцы будут направлены экспертам для проведения генетической экспертизы.
Все мои родственники (у нас очень сильный, многочисленный и богатый род) утверждают древность происхождения нашего рода (возможно, наш первый русский предок был младшим сыном Великого князя Литовского Ольгерда Гедеминовича). Я хотела проверить эту версию генетической экспертизой. Возможно ли уточнить моё литовское происхождение и причастность к Гедеминовичам и Рюриковичам?
Да, мы можем установить Вашу Y-хромосомальную гаплогруппы и тем самым определить, откуда произошли Ваши предки. Однако, к какой гаплогруппе принадлежал Ваш предполагаемый предок (князь Литовский Ольгерд Гедеминович) не представляется возможным, из-за отсутствия его биоматериала. Более того, ДНК-генеалогия оперирует понятиями в десятки тысяч лет, а не тысячи лет.
С другой стороны, установив Вашу гаплогруппу, Вы можете в соответствующих базах данных искать близких Вам родственников и, вступая с ними в контакт, устанавливать общих, более далеких Ваших родственников. В настоящий момент мы определяем принадлежность к Y-хромосомальной гаплогруппе по 17-ти маркерам Y-хромосомы.
Может ли исследование на отцовство проводиться без образцов биоматериала отца?
Да, может. Для этого потребуются образцы биоматериала ближайших родственников отца – отца, матери, сиблингов (потомков одних родителей) и т.д. Чем ближе по родословной родственник к отцу, тем точнее будут результаты и выше вероятность родства. Более того, можно предоставить биологический материал нескольких родственников по отцу, например: отца и матери, нескольких сиблингов, детей от другой женщины и т.д. В этом случае достоверность экспертизы возрастает и может составить более 99,99%.
Отцом ребенка является мой родной брат, может ли анализ ДНК показать, что отцом являюсь я?
Нет. У родных братьев всего 50% одинаковых генов, поэтому, если Вы не отец ребенка, экспертиза это подтвердит.
Как правильно читать результат анализа ДНК?
В экспертном заключении есть две главные характеристики родства – это индекс родства и вероятность родства. Индекс родства – это число, показывающее отношение двух вероятностей. Индекс родства показывает, во сколько раз вероятность прямой гипотезы (исследуемые лица — родственники) больше, чем вероятность обратной гипотезы (исследуемые лица не родственники).
Вторая характеристика показывает в процентах вероятность родства, которая рассчитывается на базе индекса родства. Вероятность родства ниже 50% свидетельствует, что предполагаемое родство исключается, вероятность от 50% до 90% говорит о неопределенности результатов ДНК-исследования, вероятность 90% и выше указывает на значительную вероятность родственной связи.
Учитываются ли мутации в расчетах вероятности родства?
Мутации вызывают ситуацию, когда аллель, наследуемый ребенком от отца, отсутствует в одном или двух локусах. В расчете индекса родства всегда учитываются эти мутации, более того, когда возникает ситуация, в которой вероятность родства находится в пределах от 50% до 90%, мы проводим дополнительное исследование (исследуются ещё 11 локусов ДНК).
Результат анализа на отцовство показывает пол ребенка?
В результатах ДНК-анализа присутствует маркер пола – амелогенин (AM). Амелогенин – ген, который находится в половых X- и Y-хромосомах. В результатах анализа указывается не только пол ребенка, но и пол всех других участников теста.
Работаете ли вы с костными материалами?
Да, мы работаем с костным материалом любой давности. Однако перед тем как извлечь образцы костей из земли или другого грунта, обязательно уточните, как такие образцы следует собирать, хранить и транспортировать. Если в дальнейшем планируется провести генетическую экспертизу, то такие материалы требуют особого ухода. Помните, что любой биологический материал – прекрасная пища для множества микроорганизмов, поэтому хранить его следует в обезвоженном или замороженном виде.
На месте преступления обнаружен клок шерсти. Можно узнать, принадлежит ли он собаке или какому-нибудь другому животному?
Какие стандарты используются для обеспечения точности ДНК исследований?
В нашей лаборатории используются международные золотые стандарты в области генетических исследований, рекомендованные Американской Ассоциацией Банка Крови (American Association of Blood Banks: Guidance for Standards for Relationship Testing Laboratories), а также Международным Обществом Судебных Генетиков (International Society for Forensic Genetics: Recommendations on biostatistics in paternity testing). Эти стандарты позволяют получать достоверные результаты, сравнимые с другими лабораториями разных стран. В сложных случаях определения родства, когда вероятность родства составляет от 50% до 90%, в нашей лаборатории проводится дополнительный анализ на 11 локусов ДНК.
Могу ли я использовать для забора буккального эпителия обычные ушные палочки?
Да, вы можете купить обычные ватные палочки и выполнить забор биоматериала самостоятельно. Однако будьте внимательны, чтобы не произошло контаминации от другого человека. Если только Вы пользуетесь палочками в Вашем доме, то можете смело брать эти палочки, если несколько человек пользуется этой упаковкой ватных палочек, то стоит купить новую упаковку и ими произвести забор щечного (буккального) эпителия.
Как долго могут храниться образцы буккального эпителия на ватной палочке?
Главное после сбора буккального эпителия — это высушить ватную палочку, поэтому мы рекомендуем упаковывать их в обычный бумажный конверт. В таком виде к нам отправляют образцы по почте, и, через три-четыре недели доставки обычным письмом, они всегда доходят до нас с пригодной для анализа ДНК.
Выполняете ли Вы экспертизу ДНК на отцовство по ногтям? Снижается ли точность анализа по сравнению с другими образцами?
Конечно, мы проводим экспертизу по ногтям. Для этого ногти должны быть сострижены с нескольких пальцев рук. На точность исследования это не повлияет, так как ДНК в клетках всего организма одинаковая.
Храните ли Вы образцы собранных ДНК?
Нет, мы уничтожаем образцы ДНК сразу после проведения исследования и получения результатов.
Выполняете ли Вы экспертизу ДНК на отцовство до рождения ребенка?
Дородовое установление отцовства возможно, но мы не советуем его проводить, так как взятие биологического материала ребенка затруднительно для врачей и очень опасно для ребенка. Конечно, лучше дождаться рождения ребенка, а потом проводить экспертизу. Если Вы всё же хотите провести такую экспертизу, то нам для исследования понадобятся образцы биоматериала матери, предполагаемого отца, а также биологический материал ребенка (например, кровь из пуповины или образец околоплодных вод). Наш центр не производит забор плодного материала, поэтому Вам нужно воспользоваться услугами какого-либо медицинского учреждения, проводящего процедуру взятия плодного материала.
Нужны ли специальные условия для хранения образцов крови? Сколько времени можно хранить кровь?
Обычно в вакуумные пробирки для взятия образцов крови входит антикоагулянт, который не дает крови сворачиваться, а также препятствует разрушению ДНК. Такая кровь пригодна в течение нескольких недель при условии хранения около +4°С. Длительное хранение возможно при заморозке до -20°С. В случае, если предстоит пересылка образцов крови, целесообразно производить её забор на салфетку или марлю, сложенную в несколько слоев, а затем высушивать получившиеся пятна крови при комнатной температуре. Такие образцы могут храниться при комнатной температуре в спрятанном от солнечного света месте более года.
Можно ли выполнить генетическую экспертизу анонимно?
Если генетическое исследование по установлению отцовства выполняется не по суду, а по частному запросу, то мы гарантируем полную анонимность всей информации. Результаты исследования будут известны только заказчику или доверенному ему лицу. Если генетическая экспертиза проводится по решению суда, то результаты передаются в суд и стороны могут ознакомиться с результатами экспертизы только в суде.
Можно ли определить, являются ли части трупа останками одного и того же человека?
Да, это возможно. Генотип каждого человека индивидуален, и, если обнаружится несовпадение аллелей в одинаковых локусах от разных частей трупа, то это будет свидетельствовать о присутствии двух (или более) различных останков людей.
Что делать, когда одна из сторон уклоняется от сдачи биоматериала несмотря на то, что генетическая экспертиза была назначена в судебном порядке?
Если одна из сторон уклоняется от участия в экспертизе и не является в назначенную экспертами дату для взятия биоматериала, суд вправе признать факт родства или его опровергнуть (согласно ст. 79.3 ГПК РФ) без проведения экспертизы. Другими словами, суд вправе вынести решение в пользу той стороны, которая не уклоняется от проведения экспертизы.
Я боюсь, что в роддоме могут подменить ребенка, могу я пройти ДНК-исследование после рождения ребенка и подтвердить, что этот ребенок действительно мой?
Конечно. Вы можете заказать генетическое исследование и быть полностью уверенной, что это Ваш биологический ребенок. Биологический материал можете выслать к нам по почте.
Я сомневаюсь в результатах проведенного ДНК исследования, что мне делать?
В нашем центре мы проводим «Рецензирование генетических экспертиз и исследований». Мы можем прокомментировать генетическое исследование сторонней организацией и, в случае необходимости, составить «Заключение специалиста по результатам рецензирования заключения».
Возможно ли установление родства различных животных (коров, собак, свиней и т.д.) или их идентификация?
В настоящее время разработаны коммерческие наборы для генотипирования не только человека, но также коров, лошадей и собак. Соответственно, возможно установление родства и идентификация соответствующих животных. К сожалению, из-за низкого спроса на данные экспертизы и ограниченный срок годности коммерческих наборов у нас (и вообще в России) выполняются только исследования собак.
С другой стороны, возможно исследовать родство двух животных по материнской линии, проведя «Генетическую экспертизу митохондриальной ДНК». Если в результате экспертизы генетический профиль мтДНК двух животных не совпадет, то это будет свидетельствовать о различном материнском происхождении двух особей, тогда как совпадение генетических профилей будет подтверждать их общее родство по материнской линии.
Аналогично можно выполнить экспертизу идентификации: если в результате экспертизы генетический профиль мтДНК двух объектов не совпадает, то это свидетельствует о двух различных животных, тогда как совпадение генетических профилей говорит о том, что это может быть одно животное или два животных, близких по материнской линии.
Таким образом, в исследовании по мтДНК имеются свои минусы и плюсы. Например, минусы — это: 1) нельзя по мтДНК доказать, принадлежит ли данный объект одному и тому же животному; 2) по мтДНК невозможно установить родство между отцом и ребенком. Плюсы: можно исследовать любых представителей царства Животных, вне зависимости от того, существуют ли разработанные коммерческие наборы или нет.
Можно ли в суде сказать, что я хочу выполнить генетическую экспертизу в вашей организации – АНО «Судебный Эксперт»?
Согласно ст. 79.2 ГПК РФ: Стороны, другие лица, участвующие в деле, имеют право просить суд назначить проведение экспертизы в конкретном судебно-экспертном учреждении или поручить ее конкретному эксперту; заявлять отвод эксперту; формулировать вопросы для эксперта; знакомиться с определением суда о назначении экспертизы и со сформулированными в нем вопросами; знакомиться с заключением эксперта; ходатайствовать перед судом о назначении повторной, дополнительной, комплексной или комиссионной экспертизы.
Можно ли определить отца ребенка между монозиготными (однояйцевыми) близнецами?
К сожалению, в такой ситуации определить отцовство не представляется возможным. Генотип монозиготных близнецов полностью идентичен.
В заповеднике имеется несколько видов животных (волков), изъятых из природы, — необходимо генетически установить их видовую принадлежность: либо родство, либо иные подвиды волка. Возможно ли это и сколько стоит такое исследование?
Определить вид животного, имея какой-либо биоматериал и тем более предполагая его волчье происхождение, не представляет труда. В этом же анализе, выполняющийся по митохондриальной ДНК (мтДНК) возможно, определить подвид животного. В данном случае мы определяем нуклеотидную последовательность гипервариабельной области мтДНК и сравниваем её с хранящимися последовательностями в базе данных NCBI.
С определением родства немного сложней. По мтДНК можно установить родство только по материнской линии. В этом случае идентичные нуклеотидные последовательности мтДНК свидетельствуют о происхождении от одной самки (мамы, бабушки, прабабушки и т.д. только по материнской линии). С другой стороны, лучше будет воспользоваться локусами находящимися на неполовых хромосомах ядерной ДНК. К счастью, собаки (Canis lupus familiaris) это пока единственные животные (не считая человека) для которых разработаны наборы для генетического типирования, т.е. возможно определение родства. Однако, поскольку генотипирование собак пользуется низким спросом в обществе, а коммерческие наборы имеют ограниченный срок годности, поэтому коммерческие компании отказываются выполнять такие исследования.
Более того есть ещё два отрицательных момента:
- популяционные частоты аллелей известны только для собак и, наверное, будет некорректно применять их для статистической оценки вероятности родства волков.
- популяция должна находиться в условиях равновесия Харди-Вайнберга, что не справедливо для изолированных популяций обитающих в заповеднике.
Цена такого анализа, как и большинства генетических исследований, высокая, из-за большой стоимости реактивов и расходных материалов.
Какие образцы генетических материалов для определения родственных отношений при помощи ДНК-анализа нужно брать у эксгумированного трупа? Возможно ли определить родство если прошло более 3 месяцев?
После трех не зимних месяцев в мягких тканях ДНК практически полностью разрушается. Поэтому чтобы получить генетический профиль, как правило, берут ногти с пальцев рук или ног (желательно несколько) и образцы косного мозга бедренной или других костей.
С другой стороны, как показывает практика, по ядерной ДНК часто не получается выполнить генетическую экспертизу эксгумированного трупа. Поэтому приходится исследовать митохондриальную ДНК (мтДНК). По мтДНК нельзя установить отцовство, но можно доказать родство по материнской линии. Для этого можно при эксгумации изъять образцы волос, ногтей и костей — фаланги пальцев рук или ног (2-3 фаланги).
Если после похорон прошло более шести месяцев, то на экспертизу по локусам ядерной ДНК можно не рассчитывать.
Большое внимание стоит уделить хранению собранного биоматериала от эксгумированного трупа. Желательно образцы хранить при -20 и не перемораживать. Можно поместить образцы в этиловый спирт и так же положить в холодильник на -20. При возможности как можно скорей передать материал в лабораторию.
Какие органы надо брать для ДНК у эксгумированного трупа для определения родственных отношений? Если прошло более 3 месяцев?
Здравствуйте, Татьяна. После трех не зимних месяцев в мягких тканях ДНК практически полностью разрушается. Поэтому чтобы получить генетический профиль, как правило, берут ногти с пальцев рук или ног (желательно несколько) и образцы косного мозга бедренной или других костей. С другой стороны, как показывает практика, по ядерной ДНК часто не получается выполнить генетическую экспертизу эксгумированного трупа. Поэтому приходится исследовать митохондриальную ДНК (мтДНК). По мтДНК нельзя установить отцовство, но можно доказать родство по материнской линии. Для этого можно при эксгумации изъять образцы волос, ногтей и костей — фаланги пальцев рук или ног (2-3 фаланги). Если после похорон прошло более шести месяцев, то на экспертизу по локусам ядерной ДНК можно не рассчитывать. Большое внимание стоит уделить хранению собранного биоматериала от эксгумированного трупа. Желательно образцы хранить при -20 и не перемораживать. Можно поместить образцы в этиловый спирт и так же положить в холодильник на -20. При возможности как можно скорей передать материал в лабораторию.
Для установления отцовства необходимо провести генетическую экспертизу, но судья предупредила, что в некоторых случаях результат может быть неверный из-за возраста ребенка (поясняя это тем, что у детей в возрасте до года может меняться группа крови). Действительно ли такой фактор может повлиять на результат экспертизы?
По группе крови уже много лет отцовство некто не устанавливает. Отцовство устанавливается по полиморфным локусам ядерной ДНК. Экспертизу по ДНК вообще можно проводить ещё до рождения ребенка, взяв плодный материал.
Ни в коем случае не нужно дожидаться пока ребенку исполниться год — Вы можете уже сейчас провести экспертизу по определению отцовства. Для этого нам понадобится несколько капель крови, или мазок ватной палочкой с внутренней стороны щеки всех лиц, участвующих в исследовании (мама/ребенок/предполагаемый отец). Вам следует ходатайствовать в суде о проведении генетической экспертизы.
Может ли комбинированный индекс отцовства быть 79,964?
Да, может, индекс отцовства принимает любые положительные значения. В этом случае вероятность отцовства (при принятии вероятности отцовства до опыта равной 50%) равна: = 79,964/( 79,964+1)=0,9876 или 98,76%.
У сына вторая положительная группа крови,у его жены тоже вторая положительная, а их дочери при сдаче анализов написали вторая отрицательная группа крови. Такое возможно?
Да, такое возможно! У родителей со второй группой крови и положительным резус-фактором, могут быть дети с 1-ой или 2-ой группой крови, и с положительным или отрицательным резус-фактором. То есть всего возможно четыре варианта: 1+, 1-, 2+, 2-.
Можно ли повергнуть генетической экспертизе биологические объекты зафиксированные в 4% формалине или 70% спирте?
Генетическую экспертизу можно сделать только в отношении объектов хранящихся в спирте. Формалин же сильно разрушает молекулу ДНК, и в 90% случаев не удается типировать ядерные локусы. С другой стороны, митохондриальная ДНК (мтДНК) более устойчива к формалину, потому что находится в клеточных органеллах, и в нашей организации получалось провести экспертизу по мтДНК. Однако надо иметь ввиду, что экспертиза мтДНК имеет свои ограничения, выражающиеся в том, что митохондрии и мтДНК ребенок получает только от матери, и установление родства в рамках исследования мтДНК возможно только по материнской линии (см. статью на нашем сайте).
Многие люди, столкнувшись с необходимостью провести ДНК-экспертизу, задаются вопросом: может ли экспертиза ДНК ошибаться? Учитывая, что нередко результат теста требуется не только по личным мотивам, но и для предоставления в суд — вопрос кажется резонным.
Эксперты центра генетических исследований Lab-DNK объясняют, что анализ не может подвергаться сомнению, если он был сделан в медицинском центре с солидной репутацией. При чем абсолютно не принципиально, является ли тест ДНК информационным (для себя), или это досудебная/судебная генетическая экспертиза по определению суда — оба анализа выполняются по совершенно одинаковой технологии, а современный профессиональный подход исключает возможность ошибки теста ДНК. В лабораториях Лаб-ДНК каждый генетический материал, принятый отделом регистрации, полностью обезличивается и только после этого передаются двум обособленным группам генетиков, после получения лабораторных результатов они сравниваются. Так как ежедневно проводятся сотни исследований, это помогает исключить человеческий фактор и предвзятое отношение.
Нередко судебные органы сами советуют надежную исследовательскую лабораторию, известную высокой квалификацией персонала и
соблюдением врачебной тайны. Стоит обратить внимание на то, заключает ли клиника договор, предоставляет ли гарантию результата
Важная информация
Суд может порекомендовать Вам экспертную организацию, но согласно федеральному закону «О защите конкуренции», Вы вправе сами выбирать исполнителя, предоставив в суд лицензии и квалификации выбранной Вами лаборатории. Зачем? Средняя стоимость установления отцовства в
государственной лаборатории — 30 000 ₽. Средняя стоимость аналогичного исследования в современных коммерческих лабораториях 13 800 ₽.
РЕЗУЛЬТАТЫ ТЕСТА ИЛИ МОЖЕТ ЛИ ДНК ТЕСТ ОШИБАТЬСЯ
ДНК тест, проводимый в инновационной лаборатории Lab-DNK, подтверждает факт отцовства на 99,9999%. Но люди постоянно интересуются, можно ли подделать анализ ДНК? Часто результат выдается с длиннющим хвостом из цифр, что еще более подтверждает факт, что конкретный мужчина приходится биологическим отцом ребенка. Кстати, специалист, проводящий экспертизу, несет уголовную ответственность за результат. Насущная проблема, может ли ошибаться генетическая экспертиза, давно волновала ученые умы и простых обывателей.
Можно ли подделать тест ДНК — Что бы ответить на этот вопрос необходимо немного погрузиться в процесс и выделить места где можно «ошибиться».
Cбор материала для выделения ДНК
Уже на этом этапе недобросовестные компании могут подменить конверты с материалом или сами зонды — как этого избежать? Ответ прост — не гнаться за ценой, так как такие компании как правило делают тесты дешевле всех (и не факт что делают), поэтому доверяйте только профессионалам, данные полученные в центре генетических исследований Лаб-ДНК можно проверить в любой независимой лаборатории.
Важная информация
По поводу качества забора ДНК — можете не переживать, если процедура выполнена халатно, то материал просто не примут в работу. Так
как либо наши генетики получат смешанный профиль (более чем от 1 человека), либо не смогут выделить профиль полностью (в случае когда материала недостаточно, или он деградировал). В обоих случаях в проведении генетической экспертизы будет отказано, а пациенты будут направлены на перезабор.
ПОДТВЕРЖДЕНИЕ ИЛИ ОПРОВЕРЖЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ТЕСТА ДНК НА ОТЦОВСТВО
Из нашей практики, результат анализа на отцовство в среднем варьируется от 99,95…. до 99,9999 (если исследование проходит по 25 локусам), или 100% если идет опровержение. Если скептики считают, что отсутствие 100%-ного результата допускает возможность ошибки, то заблуждаются как раз они. Индекс отцовства рассчитывается как суммарное произведение индексов по каждому локусу и, исходя из формулы, просто не может достичь 100 процентов.
Поэтому, тем, кто думает над вопросом, может ли экспертиза ДНК ошибаться, стоит просто более детально разобраться в тонкостях процесса
Интересный факт (может ли тест днк быть ошибочным?)
Да — может. Небольшая доля процента отведена на то, что у каждого предполагаемого отца есть теоретический однояйцевый брат близнец. Однояйцевые близнецы полностью идентичны с точки зрения генетики, поэтому результаты теста на отцовство у близнецов будут абсолютно идентичны.
МОЖЕТ ЛИ ЭКСПЕРТИЗА ДНК ОШИБАТЬСЯ?
Для начала нужно понять, чем все таки отличается ДНК экспертиза от теста ДНК. Технически — это два абсолютно одинаковых теста. Разница только в процедуре забора биологического материала для выделения ДНК и оформлении/виде отчета.
Когда мы говорим про обычное исследование ДНК, подразумевается, что материал может быть собран как сотрудниками центра, так и обычно человеком. Материал может быть как стандартный (буккальный эпителий) так и не стандартный. Такой тест ДНК можно сделать как официально, так и полностью анонимно. Результат исследования выдаётся на фирменном номерном бланке (гербовая бумага с водяными знаками, за личной подписью эксперта генетика).
Когда мы подразумеваем генетическую экспертизу с цель установления отцовства/материнства (или любого другого родства) — тут все строго! Все участники исследования обязаны иметь документы удостоверяющие личность, забор биологического материала для
Важно!
Если один из участников не совершеннолетний, его должны сопровождать родители (подтверждается свидетельством о рождении). Если таковой возможности нет, ребенок должен сопровождаться официальным опекуном, что подтверждается документом о опеке.
Выделения ДНК осуществляется в присутствии свидетелей с подписью под 307 ст. УК РФ. Все документы ксерокопируются и заверяются, а если в исследовании ДНК присутствуют несовершенно летние — они фотографируются для идентификации личности. Конверты с биообразцами запечатываются, проштамповываются. Вскрытие конвертов в лаборатории производится под фотофиксацию, а результат отчета предоставлен на 25-30 листах и опломбирован.
В принципе — обмануть ДНК тест практически невозможно, тем более, если это генетическая ДНК экспертиза! Образцы заключений выглядят следующим образом!
Образец информационного
теста ДНК отцовство
Образец заключения о проведении судебной (досудебной)
генетической экспертизы с целью установления отцовства
ПРАКТИКА
Как устроен процесс выделения ДНК в лаборатории
Рассказываем, как проходит первый этап генетического исследования — выделение геномной ДНК из биологических образцов.
Что такое ДНК
ДНК — это длинная молекула с отрицательным зарядом: она кодирует инструкцию по сборке отдельных белков, клеток, тканей и целых организмов. ДНК содержится во всех клетках за редкими исключениями: например, зрелые эритроциты млекопитающих теряют ядро с генетическим материалом, чтобы лучше переносить кислород. Поэтому выделить ДНК можно из любой ткани живого или мертвого организма — вопрос только в том, сколько усилий придется затратить.
Сотрудники лаборатории Genotek успешно справлялись с иголками сосны, стволовыми клетками, йогуртами, зародышами лягушек, сердцами мышей и золотистым стафилококком, а автор этой статьи на студенческом практикуме выделяла ДНК из консервированной кукурузы. Но чаще всего источником генетического материала для анализа становится кровь или слюна человека.
Анна Красненко
Руководитель лаборатории Genotek
В слюне содержатся клетки эпителия внутренней поверхности щек — это надежный источник ДНК. Важным преимуществом является безболезненность и неинвазивность данного типа сбора биоматериала.
Зачем выделять ДНК?
Обработка биоматериала и выделение ДНК — это первый этап молекулярно-биологического исследования. Генетический материал хранится в ядрах клеток, которые нужно разрушить, иначе ДНК не выйдет в раствор и будет недоступна для анализа. Из клеток животных часть ДНК можно высвободить простым нагреванием, а вот с клетками растений это не пройдет: они защищены прочной клеточной стенкой из целлюлозы.
Чтобы анализ прошел успешно, важно очистить ДНК от примесей. Примеси ингибируют активность ферментов, которые нужны для подготовки образка к анализу на секвенаторе или чиповом анализаторе.
Самые распространенные ингибиторы в биологических тканях — это гем (компонент эритроцитов, который позволяет им переносить кислород), коллаген в костях и других соединительных тканях, меланин в волосах и коже, ароматические соединения в растительных образцах, миоглобин в тканях мыщц (1, 2). В слюне анализу мешают остатки пищи и консервант, который используется для хранения и перевозки образца: он содержит SDS, ингибирующий работу ферментов. При перевозке SDS защищает ДНК от разрушения, но при попадании в реакционную смесь нарушает работу ДНК-полимеразы.
Анна Красненко
Руководитель лаборатории Genotek
При криминалистических исследованиях для ДНК-идентификации достаточно луковицы волоса или кусочка кожи. Но для полногеномных исследований необходима неразрушенная ядерная и митохондриальная ДНК, поэтому мы используем в своей работе слюну и кровь, а так же реагенты ведущего производителя на рынке.
Фридрих Мишер и выделенная им ДНК (источник)
Кто выделил ДНК первым
Открыл ДНК швейцарский врач Фридрих Мишер, когда изучал лейкоциты из гноя на хирургических повязках. В 1869 году Мишер заметил, что при выделении белков из лейкоцитов в осадок выпадает вещество с кислотными свойствами, которое он назвал «нуклеином». Позднее Мишер использовал для получения нуклеина молоки лососевых рыб, которых собственноручно ловил в Рейне, и писал о роли вещества в оплодотворении. Однако роль ДНК в передаче наследственной информации еще долго не замечали: ученые считали, что она слишком просто устроена для вещества, в котором записаны наследственные признаки. Только через 83 года генетическую роль нуклеиновой кислоты установили исследователи Херши и Чейз.
В 1952 году Херши и Чейз доказали, что наследственная информация содержится в ДНК, а не белках, как считали до этого. Ученые работали с бактериофагом Т2 — вирусом, заражающим кишечную палочку. Бактериофаг состоит из белковой оболочки и молекулы ДНК внутри нее. Оболочка содержит атомы серы, а ДНК аккумулирует 99% фосфора. Херши и Чейз кормили бактериофагов радиоактивными изотопами фосфора и серы, чтобы меченые атомы включились в состав оболочки и ДНК. Радиоактивными фагами ученые заражали бактерий и изучали вирусное потомство. Так они выяснили, что дочерние фаги наследуют 30% меченого фосфора и менее одного процента серы. При заражении белковая оболочка вируса остается прикрепленной к мембране клетки, а внутрь нее попадает только ДНК. Херши и Чейз отмыли оболочки с поверхности клеток, чтобы проверить, нужны ли они для размножения фагового потомства. Оказалось, что без белковых «теней» фаги размножаются так же эффективно, как с ними. Результаты эксперимента А. Херши и М. Чейз стали решающим доказательством роли ДНК в передаче наследственной информации.
Как выделяют ДНК
в лаборатории
Наш робот в процессе выделения ДНК
В лаборатории Genotek выделение ДНК полностью автоматизировано: робот не ошибается и не устает. Процесс выделения происходит в несколько шагов:
- Разрушаем мембраны клеток и клеточных ядер, чтобы все содержимое клетки — ДНК, белки, липиды и сахара — вышло в раствор. Для этого используем лизисный буфер с детергентом SDS (для слюны) или тиоцианатом гуанидина (для крови). Детергент разрушает мембраны, а буферный компонент раствора поддерживает pH на оптимальном для ДНК уровне. Лаурилсульфат натрия (SDS) входит в состав обычного шампуня, а вот тиоцианат гуанина токсичен и вызывает щелочные ожоги при попадании на кожу. Его агрессивные денатурирующие свойства используют при изучении испанского гриппа: инактивированные вирусные частицы становятся безопасными для исследователей.
- Избавляемся от белков. Вышедшую в раствор ДНК нужно освободить от связанных с ней белков. Одновременно с этим необходимо инактивировать ДНКазы — ферменты, которые атакуют «оголенную» ДНК. За разрушение клеточных белков отвечает еще один компонент лизисного буфера — протеина К, фермент, который получают из микроскопических грибов рода Engyodontium album.Буква К в названии указывает на способность расщеплять кератин, белок ногтей и волос.
- Отделяем ДНК от примесей. Центрифугируем раствор в пробирках с кремниевой мембраной, которая связывается с ДНК и пропускает остальные органические компоненты клетки. Центрифугирование многократно увеличивает скорость фильтрации сквозь мембрану. Мембрану со связанной ДНК несколько раз промывают спиртом — изопропанолом или этанолом.
- Растворяем ДНК в буфере для хранения. Связанную с мембраной ДНК отмывают буфером для элюции (элюцией называют процесс выведения в раствор адсорбированного вещества). Растворенная в буфере ДНК может храниться при −20°С в течение нескольких лет
Как оценить качество ДНК
При неправильном сборе, некорректном или слишком долгом хранении биологических образцов ДНК в клетках разрушается. Такие образцы подходят для анализа небольших фрагментов генома (например, при установлении отцовства), но непригодны для исследований, где важно прочитать всю генетическую последовательность (секвенирование) или проанализировать одновременно сотни тысяч нуклеотидов в разных участках ДНК (генотипирование на микрочипах).
Отсутствие деградации геномной ДНК проверяют электрофорезом в агарозном геле. Под действием тока отрицательно заряженные молекулы ДНК движутся к аноду со скоростью, пропорциональной их размеру. Геномная ДНК хорошего качества выглядит на форезе четкой полоской, а некачественная ДНК «шмерит» — формирует градиент из фрагментов разных длин. Такой образец нельзя брать на анализ.
Что делать, если контроль не пройден
Важно, чтобы ДНК не разрушилась при перевозке и хранении биообразца. Для этого в пробирку добавляют консервант. Если слюны больше, чем требуется, консервант не сработает. Если слюны мало, ДНК не хватит для анализа. Поэтому все поступившие в лабораторию пробирки оценивают визуально и в случае проблем сразу отправляют на перезабор.
Иногда не получается выделить качественную ДНК из внешне пригодного образца. Тогда лаборатория делает вторую попытку, используя оставшуюся порцию слюны, чтобы исключить технические ошибки. Если она тоже оказывается неудачной, мы приглашаем клиента на перезабор и просит внимательно соблюдать правила сдачи биоматериала: важно, чтобы в слюне оказалось достаточно клеток эпителия щек и не было посторонних примесей.
К сожалению, в слюне некоторых людей от природы содержится слишком мало ДНК. Поэтому, если на «пересдаче» человек проваливается, мы предлагаем ему сдать кровь.
ДНК, прошедшую контроль качества, направляют на секвенирование или генотипирование на микрочипах.
Комплексные ДНК-тесты — ваша инвестиция в расширенный доступ к персональной генетической информации
Инвестиция в будущее: выдаем расшифровку всех 3 млрд. маркеров генома.
Подпишитесь на нашу рассылку, и мы все подробно расскажем. Это бесплатно.
Команда «Биокор Текнолоджи» разрабатывает тест-системы и наборы для молекулярной диагностики методом ПЦР, и расскажет в этом материале, на какие детали стоит обратить внимание для предотвращения ложноположительных и ложноотрицательных результатов.
ПЦР является универсальным методом лабораторной диагностики, позволяющим идентифицировать даже не собственно вирус или бактерию в биологическом материале, а участки их РНК или ДНК.
Чувствительность ПЦР-анализа приближается к 10-100 копиям генетического материала возбудителя на реакцию. Для сравнения, если человек находится в активной фазе развития заболевания, то его биологический материал содержит миллионы геномов возбудителя на миллилитр, что, после выделения нуклеиновой кислоты будет равно нескольким тысячам копий на реакцию.
В мире, и в Украине в частности, с начала эпидемии COVID-19 ведутся дискуссии относительно того, насколько надежной является такая методика. Одни источники говорят, что ошибочным может быть каждый четвертый тест, другие указывают, что количество ложноположительных и ложноотрицательных результатов составляет лишь несколько процентов. Учитывая актуальность темы, рассмотрим на примере ПЦР для диагностики COVID-19 по каким причинам могут возникать сомнительные или ошибочные результаты. Большинство указанных аспектов имеет место и в случае с ПЦР-тестированием других инфекционных заболеваний человека.
Особенности выбора места для взятия биологического материала
Такие возбудители, как SARS-CoV-2, способны поражать значительное количество органов. Для исследования на COVID-19 обычно берутся мазки из горла или носоглотки, где возбудитель в большом количестве находится ограниченное время — на 5-10 день от начала инфицирования, далее он спускается ниже — к бронхам и легким. Поэтому отрицательный результат ПЦР-теста не может исключать факта инфицирования пациента COVID-19.
С одной стороны, риски получить ложноотрицательный результат ПЦР-теста несколько возрастают на 1-7 день от начала инфицирования, когда количество вируса мало, а также на 10-30 день, когда, во-первых, COVID-19 уже «ушел» ниже, и, во-вторых, в организме уже присутствуют в достаточном количестве антитела, и размножение вируса более или менее эффективно сдерживается иммунной системой. С другой стороны, в некоторых случаях, мы можем получить сомнительно положительный результат ПЦР-теста даже на 60-й день от начала инфицирования, когда человек уже переболел, но в ее биологическом материале все еще можно найти обломки вируса. Все вышесказанное касается только некоторых отдельных случаев и не имеет характера «абсолютной закономерности».
Алгоритм тестирования регламентирован на государственном уровне и, если существует обоснованное подозрение на инфицирование COVID-19, для уточнения диагноза могут проводить ПЦР-анализ повторно.
Неправильное взятие биологического материала
Во избежание ложноположительных результатов вследствие загрязнения — попадание молекул ДНК/РНК из внешней среды, — клинический материал необходимо отбирать стерильными одноразовыми инструментами в одноразовые стерильные пробирки согласно установленным стандартам МОЗ. Взятие материала должны проводить медицинские работники, одетые в средства индивидуальной защиты.
Недостаточное количество биологического материала может привести к ложноотрицательным результатам исследования. В некоторых случаях, эту проблему можно отследить на этапе выделения нуклеиновых кислот или в процессе амплификации (при условии использованием в диагностических наборах для обнаружения SARS-CoV-2 внутреннего контроля, то есть фрагмента генома человека).
Несоблюдение температуры и сроков хранения
Учитывая возможность распада РНК в клиническом материале, сроки хранения и транспортировки должны быть минимальными. В идеальном случае все мазки нужно транспортировать в лабораторию в течение 24-48 часов с момента взятия в специальном транспортной среде при температуре плюс 4 °C. Транспортная среда должна содержать специальные реагенты — муколитики, обеспечивающие разрушение слизи, которая подавляет ПЦР. Если отсутствует возможность своевременно доставить образцы материалов в лабораторию, их можно замораживать до минус 70 °C, используя для этого твердую углекислоту — «сухой лед». Образцы можно хранить в лаборатории в течение недели при температуре минус 20 °C, или до месяца при температуре минус 70 °C. Критическим моментом является количество замораживаний/размораживаний образца: чем их больше, тем ниже качество образца и, вследствие этого, и чувствительность метода в целом.
В результате нахождения образцов в транспортной среде больше срока, рекомендованного производителем, происходит рост естественной бактериальной микрофлоры, которая обычно находится в ротовой полости человека, и разрушение молекул вирусной РНК в образце. При использовании специальных консервантов и стабилизаторов, биоматериал может храниться в температурном диапазоне в соответствии с инструкцией производителя сроком до месяца.
Выделение нуклеиновых кислот
ПЦР-исследование не проводится непосредственно на биологических образцах и требует предварительной пробоподготовки. На этом этапе большое значение имеет качество наборов для экстракции нуклеиновых кислот, которые должны обеспечить выделение образца соответствующей концентрации и степени очистки от примесей, подавляющие ПЦР. Из-за неправильного выбора набора также может быть потеряна часть или даже все РНК возбудителя, что может приводить к ложноотрицательным результатам. Качество и чистоту нуклеиновых кислот можно проверить с помощью специального аналитического прибора — спектрофотометра. Он есть во многих лабораториях, осуществляющих ПЦР-исследования.
Выделенную из образцов РНК можно хранить при температуре минус 20 °C до недели. Для более длительного хранения нужна температура минус 70 °C. Также можно использовать специальные реагенты, стабилизирующие РНК и предупреждают ее деградации (например, DEPC — диэтилпирокарбонат).
Амплификация
Процесс амплификации (увеличение копий участков ДНК, которые обычно содержат необходимые фрагменты целевых генов) может включать до 45 циклов, во время каждого из них количество копий удваивается. Он обеспечивается реагентами, которые входят в диагностические наборы для выявления SARS-CoV-2, и приборами, обеспечивающими циклическую смену температур — амплификаторами.
Для обеспечения корректных результатов, качество диагностических наборов является первоочередным требованием. Также лаборатории должны проводить процедуру их верификации, проведя сравнительные испытания с собственными панелями референтных образцов и решениями от других производителей. Наборы должны поступать в лаборатории в термобоксах с холодовыми блоками и храниться при температуре минус 20 °C. Несоблюдение условий их транспортировки или хранения приводит к повреждению компонентов наборов, и, вследствие того, к ложноотрицательным результатам. Чтобы предупредить эту ошибку, в состав каждого диагностического набора входит положительный контрольный образец, задачей которого является установление работоспособности реагентов.
Диагностические наборы должны быть совместимыми с амплификаторами, используемыми в лаборатории. Реагенты, входящие в состав набора, меченные различными флуоресцентными красителями. Детекция флуоресцентного сигнала от каждого красителя происходит в определенном диапазоне (на определенном «канале»). Если прибор имеет слабую чувствительность по определенным флуоресцентным каналам, это может приводить к ошибочным результатам. Во избежание ошибок работники лабораторий должны проверять исправность работы приборов, а также настройки параметров работы и протоколов амплификации.
Контаминация образцов
При несоблюдении мер безопасности в помещениях лаборатории могут накапливаться продукты амплификации. Это приводит к контаминации образцов, и, в общем итоге, к ложноположительным результатам. Для подтверждения отсутствия загрязнения, каждую серию ПЦР-исследований нужно сопровождать постановкой негативных контрольных образцов, включенных в состав диагностических наборов для выявления SARS-CoV-2.
Перекрестная контаминация может возникать из-за попадания аэрозольных частиц от соседнего образца, содержащего вирусную РНК, при внесении образцов в ПЦР-смесь. На этапе амплификации контаминированный образец издает слабый положительный результат, который означает, что в исследуемой пробе обнаружено очень малое количество вируса. Но такой результат также может указывать, что человека тестировали до наступления полного выздоровления и уровень вируса в его организме был низким.
Способы предупреждения контаминации — использование наконечников с фильтрами, химическая и ультрафиолетовая дезинфекция всех рабочих поверхностей, наличие отдельных наборов дозаторов, оборудования, халатов и перчаток для каждой зоны, проведения внутрилабораторного и внешнего контроля качества исследований — регламентированы на государственном уровне.
Другими эффективными, однако дорогостоящими мероприятиями для предотвращения контаминации является автоматизация этапов выделения нуклеиновых кислот и амплификации, а также двойной контроль — постановка каждого образца в двух параллельных реакциях.
Ошибки обработки данных
Расчеты результатов ПЦР в реальном времени проводятся с использованием компьютерных программ. Амплификатор в автоматическом режиме измеряет интенсивность флуоресценции в образцах на каждом цикле. Кривая амплификации имеет так называемую фазу экспоненциального роста, после которой следует фаза плато. Автоматическая интерпретация результатов не всегда дает правильный результат, поэтому рекомендуется проводить анализ кривых амплификации на предмет пересечения пороговых значений, и корректировать задачи пороговых значений по мере необходимости. Для большей достоверности можно сравнить такую сомнительную кривую с кривой подтвержденного положительного образца.
Подытожим
На каждом этапе исследования являются условия, несоблюдение которых может привести к недостоверным результатам. Некоторые из потенциальных ошибок являются общими для большинства видов лабораторной диагностики (например, ошибки при взятии и хранения образца, настройка оборудования), тогда как другие являются специфическими только для этого вида исследования (например, контаминация образцов, низкое качество выделенных нуклеиновых кислот).
ПЦР — многостадийный метод, и для получения максимально достоверных и воспроизводимых результатов необходимо надлежащее выполнение каждого этапа процесса в соответствии со стандартами МОЗ и инструкциями производителей. Вторым важным условием является качество всех реагентов и расходных материалов, используемых в ПЦР: систем для сбора биологических материалов, наборов для выделения нуклеиновых кислот, диагностических наборов для выявления SARS-CoV-2.